实验九 培养基的配制和高压蒸汽灭菌

一．实验目的

1. 了解微生物的营养需求。 2. 学习并掌握培养基配制的方法。

3. 学习并掌握高压蒸汽灭菌原理和培养基的灭菌方法。

二．实验原理

培养基是由人工配制的、微生物在实验室的生长环境。在合适的营养物组成的培养基上，微生物吸收培养基中的水分和营养物质，从中获得能量并合成组成细胞所需的物质和代谢产物。

微生物的种类繁多，不同营养类型的微生物对营养物质的要求也不同，必须根据微生物对营养的要求以及研究的目的配制合适的培养基。

除了营养物质以外，培养基的pH也是一个很重要的因素。因为pH会影响到培养基中营养物质的离子化程度，还会影响到微生物代谢过程中各种酶的活性。因此配制培养基时一定要了解微生物对环境pH的要求。

为防止配制好的培养基中微生物的生长，因此配制好的培养基必须立即灭菌。对于培养基的灭菌，一般采用湿热灭菌即高压蒸汽灭菌。高压蒸汽灭菌是利用高温引起菌体蛋白质凝固变性而达到灭菌效果的。

三．实验器材

1. 培养基成分：牛肉膏，蛋白胨，氯化钠，琼脂 2. 试剂：1mol/L NaOH溶液，1mol/L HCl溶液 3. 玻璃器皿：三角烧瓶，烧杯，量筒，试管，漏斗

4. 其它材料：pH试纸，搅棒，纱布，电子秤，药匙，棉塞，牛皮纸，棉线，记号笔等

四．实验步骤

1. 培养基的配制

（1）称量：根据牛肉膏蛋白胨培养基配方（详见附录II）和配制培养基的量计算出各种成分所需用量，选用精度合适的台秤准确称取各种成分。

（2）溶解：一般情况下，几种培养基成分可一起倒入烧杯内，然后加入少于所需要的水量，加热溶解。加热溶解时要不断搅拌，待各成分完全溶解后，补足水分至所需配制的体积。如有磷酸盐和钙镁盐等混合在一起时易产生沉淀，则要分别溶解，或将盐配成母液，另外配制有淀粉的培养

基，应先将淀粉糊化。

（3）调节pH值：培养基配好后，先用pH试纸或pH计测出其原始pH值，然后用1mol/L NaOH溶液或1mol/L HCl溶液调节至需要的pH。 （4）分装：

a．斜面培养基分装：量取所需体积的液体培养基倒入烧杯中，加入1.5%~2.0%（w/v）琼脂，搅拌均匀并加热使其完全融化，最后用热水补足因蒸发而损失的水分（注意在加热融化琼脂的过程中要不断搅拌，以防琼脂沉淀而烧焦）。趁热分装于15×150mm试管中，每支试管加量约2~3ml。 b. 半固体培养基分装：除了琼脂加量为0.5%~1.0%（w/v），其他同斜面培养基分装。趁热在15×150mm试管中加入4ml培养基。

c. 液体培养基的分装：直接将配制好的培养基分装于15×150mm试管或250ml三角瓶中。15×150mm试管装3~4 ml，250ml三角瓶装25~100ml。

d. 固体培养基三角瓶的分装：直接在三角瓶中按1.5~2.0%（w/v）加入琼脂，然后加入一定体积的液体培养基。一般250ml三角瓶装100ml培养基。注意琼脂不必加热融化，因为在灭菌时琼脂会融化的。

（5）加塞：试管口和三角瓶口塞上合适的棉塞或硅胶塞。（图4-1）

（6）包扎

图4-1 棉塞（左：A正确，B、C错误）和硅胶塞（右）

a．试管包扎：5~8支为一捆，在棉塞外包一层牛皮纸，用棉线扎好。图4-2A b. 三角瓶的包扎：在棉塞外包一层牛皮纸，用棉线扎好。图4-2B

图4-2 试管和三角瓶的包扎

（7）灭菌：将包扎好的培养基放入高压蒸汽灭菌锅内，121℃灭菌30min。详细操作如下： a．灭菌锅内加水：灭菌前检查灭菌锅的水位是否在刻度范围，如水位低于要求，务必向锅内加水，使水位在要求的刻度范围。加的水最好用去离子水。

b. 放置灭菌物品：为了达到良好的灭菌效果，每次放置物品的量要适合，培养基和物品叠放不能过于紧密。

c. 盖上灭菌锅锅盖，旋紧灭菌锅的螺丝，使灭菌锅密闭。

d. 接通电源进行加热，同时打开灭菌锅的排气阀，当水煮沸时，大量蒸汽从排气阀中冲出，冷空气也随之排出，冷空气被排尽后关上排气阀。

e. 升温保压：此时灭菌锅内蒸汽压力和温度逐渐上升，当灭菌锅压力指示达到额定工作压力时，如果灭菌锅有自动控制系统，则自动控制压力，此时开始计算灭菌时间。如果无自动控制系统，必须仔细地控制灭菌锅的压力，保持其在整个灭菌时间内处于所需的压力，尽可能减小波动。灭菌常用的压力为0.11MPa，对应的温度为121℃。灭菌时间30min。

f. 降压冷却：灭菌时间到后，停止加热，让灭菌锅内的压力自然下降，当压力表指示为“0”时，再打开排气阀，打开锅盖，取出灭菌物品。

（8）斜面的摆放：对于斜面培养基，灭菌后趁热将试管搁在长木条上（图4-3），并调整坡度，使斜面培养基的长度不超过试管总长的一半，待冷却凝固后备用。

图4-3 培养基试管斜面的摆放

五．实验记录

1. 培养基配制和灭菌记录

表4-1 配制培养基和灭菌记录表

培养基名称 灭菌前pH 配制量(ml) 灭菌后pH 培养基成分 药品名称 含量（g/L） 需要量（g） 实际称量值（g） 生产厂商 规格 配制日期 培养基分装 灭菌前 15×150试管 液体 装量（ml） 数量装量（ml） （支） 15×150试管 半固体 装量（ml） 固体 （ml） （支） 培养基灭菌 灭菌温度（℃） 灭菌时间（min） 灭菌锅压力（Pa） 灭菌过程 开始灭菌时间 备注：

达到121℃时间 保温结束时间 保温维持时间 15×150试管 装量数量装量（ml） （瓶） 数量（支） 250ml三角瓶 数量 数量（支） 15×150试管 （瓶） 250ml三角瓶 数量 数量（支） 15×150试管 灭菌后 250ml三角瓶 数量（瓶） 15×150试管 数量（支） 250ml三角瓶 数量（瓶） 灭菌锅型号 灭菌锅打开时间 整个灭菌时间

六．实验注意事项

1. 如培养基成分中的盐类，如放在一起溶解会反应产生沉淀，则要分别溶解。

2. 如培养基中含有淀粉，则淀粉需要先糊化。淀粉糊化方法：用一烧杯盛一定量的水，加热至沸腾后，慢慢倒入事先用少量冷水调匀的淀粉，混匀即可。

3. 注意培养基对pH的要求。

4. 加热融化琼脂时，要不断搅拌，以免琼脂沉淀烧焦。

5. 灭菌锅是高压容器，使用时必须按使用说明操作，以免发生事故。 6. 灭菌结束后，一定要等压力表指示为“0”才能打开锅盖。

七．预习思考题

1. 列表对比各种灭菌方式，包括原理、适用范围等。 2. 试分析下列高压蒸汽灭菌操作要点的原理： （1）为什么灭菌时灭菌锅内最好添加去离子水？ （2）灭菌时必须将灭菌锅中的空气排尽； （3）灭菌一般条件为121℃，15~30min；

八．思考题

1. 用高压蒸汽灭菌，如何达到较好的灭菌效果？

2. 在同样条件下，为什么湿热灭菌的效果比干热灭菌的效果好？

3. 高压蒸汽灭菌后，为什么锅内压力要慢慢降低？为什么压力表指示须降到“0”才能打开锅盖？ 4. 配制好的培养基为什么须即刻灭菌？