⒎将重组DNA导入细胞内有哪些方法？它们的原理是什么？

答：根据重组DNA时所采用的载体性质不同，导入重组DNA分子有转化、转染、感染和注射等不同手段。

：①转化，用质粒作载体所常用的方法。②转染，用噬菌体DNA作载体所用的方法，这里所用的噬菌体DNA并没有包上它的外壳。③转导，用噬菌体作载体所用的方法，这里所用的噬菌体DNA被包上了它的外壳，不过这外壳并不是在噬菌体感染过程中包上，而是在离体情况下包上的，所以称为离体包装。④注射，如果宿主是比较大的动植物细胞则可以用注射方法把重组DNA分子导入。

⒏基因文库和cDNA文库有何不同？为什么要建立cDNA文库？

答：基因文库是指整套由基因组DNA片段插入克隆载体获得的分子克隆之总和。cDNA文库是指细胞全部mRNA逆转录成cDNA并被克隆的总和。cDNA组成特点是其中不含有内含子和其他调控序列。

真核生物的基因是断裂的，需经RNA转录后加工过程才使编码序列拼接在一起；真核生物的基因不能直接在原核生物中表达，只有加工成熟的mRNA经逆转录合成的cDNA接上原核生物表达控制元件，才能在原核生物中表达；另外，真核生物细胞中只有一小部分mRNA进行表达，mRNA的稳定性差。因此，需要构建cDNA文库，用于基因表达等方面的研究。

⒐建立人胚cDNA文库，以致人胚低丰度mRNA为28 000种，占总mRNA的40%，为使低丰度cDNA存在的概率大于99%，此文库应包含多少克隆？ 答：3.2×105。

⒑原位杂交的原理是什么？有何用途？

答：将标记的核酸探针与细胞或组织中的核酸进行杂交，称为原位杂交。

利用原位杂交，可在光镜或电镜下观察目的 mRNA或DAN 的存在与定位；可在原位研究细胞合成某种多肽或蛋白质的基因表达。

⒒何谓差别杂交和扣除杂交？举例说明用以分离基因的过程。

答：差别杂交（differential hybridization）又叫差别筛选（differentual screening），适用于分离经特殊处理而被诱发表达的mRNA之cDNA克隆。为了增加这种方法的有效性，后来又发展出了扣除杂交技术。扣除杂交（subtractive hybridization）又叫扣除cDNA克隆（subtractive cDNA cloning），它是通过构建扣除文库（subtractive library）得以实现的。

差别杂交的技术基础需要有两种不同的细胞群体：在一个细胞群体中目的基因正常表达，在另一个细胞群体中目的基因不表达。在这种情况下便可制备到两种不同mRNA提取物。其一是含有一定比例的目的基因mRNA种的总mRNA群体，其二是不含有目的基因mRNA种的总mRNA群体。通过这两种总mRNA（或是它们的cRNA拷贝）为探针的平行杂交，对由表达目的的基因的细胞总mRNA构建的克隆库进行筛选。当使用存在目的基因的mRNA探针时，所有包含着重组体的菌落都呈阳性反应，在X光底片上呈现黑色斑点；而使用不存在目的基因的mRNA探针时，除了含有目的基因的菌落外，其余的所有菌落都呈阳性反应，在X光底片上呈现黑色斑点。比较这两种底片并对照原平板，便可以挑选出含目的基因的菌落，供作进一步研究使用。

扣除杂交是用一般细胞的mRNA与特殊细胞的cDNA杂交，先扣除一般共有的cDNA，再交剩下特异的cDNA进行克隆。

下面以T 细胞受体（T-cell receptor，TCR；有时亦称之为T细胞抗原受体）编码工因的

分离为例子，说明扣除杂交筛选法的基本原理与简要过程。 TCR基因只能在T细胞中表达，而不能在B细胞中表达。从T细胞mRNA制备来的单链cDNA，同大大超量的B细胞的mRNA在有利于发生DNA-RNA杂交的条件下保温，所有的能够在T和B两类细胞中同时表达的T细胞基因的cDNA分子（约占98%），都能与B细胞的mRNA退火形成DNA-RNA杂交分子，而不能在B细胞中表达的、T细胞特有的cDNA（约占2%），由于B细胞中没有相应的mRNA，仍然处于单链的状态。将此种杂交混合物通过羟基磷灰石柱（hydroxylapatite column），于是DNA-RNA杂交杂分便结合在柱上，而游离的单链cDNA则过柱流出。如此回收入到的T细胞特异的cDNA被转变为双链cDNA之后，与适当的λ噬菌体载体重组并转染给大肠杆菌寄主细胞，这样便得到了T细胞持cDNA高度富集的扣除文库。然后再按照同样方法制备扣除的cDNA探针，即被B细胞mRNA杂交扣除了的T细胞特异的cDNA探针，筛选文库，结果成功地分离到了T细胞的TCR基因。

⒓说明聚合酶链式反应(PCR)的原理和用途。

答：聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法，为最常用的分子生物学技术之一。典型的PCR由（1）高温变性模板；（2）引物与模板退火；（3）引物沿模板延伸三步反应组成一个循环，通过多次循环反应，使目的DNA得以迅速扩增。其主要步骤是：将待扩增的模板DNA置高温下（通常为93℃-94℃）使其变性解成单链；人工合成的两个寡核苷酸引物在其合适的复性温度下分别与目的基因两侧的两条单链互补结合，两个引物在模板上结合的位置决定了扩增片段的长短；耐热的DNA聚合酶（Taq酶）在72℃将单核苷酸从引物的3’端开始掺入，以目的基因为模板从5’→3’方向延伸，合成DNA的新互补链。

PCR能快速特异扩增任何已知目的基因或DNA片段，并能轻易在皮克（pg）水平起始DNA混合物中的目的基因扩增达到纳克、微克、毫克级的特异性DNA片段。因此，PCR技术一经问世就被迅速而广泛地用于分子生物学的各个领域。它不仅可以用于基因的分离、克隆和核苷酸序列分析，还可以用于突变体和重组体的构建，基因表达调控的研究，基因多态性的分析，遗传病和传染病的诊断，肿瘤机制的探索，法医鉴定等诸多方面。通常，PCR在分子克隆和DNA分析中有着以下多种用途： (1) 生成双链DNA中的特异序列作为探针； (2) 由少量mRNA生成 cDNA文库； (3) 从cDNA中克隆某些基因；

(4) 生成大量DNA以进行序列测定； (5) 突变的分析； (6) 染色体步移；

(7) RAPD、AFLP、RFLP等DNA多态性分析等。

⒔基因定位诱变的主要方法有哪几种？它们的原理是什么？

答：基因定位诱变的主要方法有酶切诱变、寡核苷酸指导的诱变和PCR诱变。 酶切诱变：利用基因的酶切位点，在切点处改造基因序列。

寡核苷酸指导的诱变：利用克隆技术将人工合成的寡核苷酸片段插入到目的基因的序列中。 PCR诱变：通过PCR引物在扩增片段的两端引入各种变异，嵌套式PCR还可以在基因内部或在一次PCR中同时在多处引入变异。

⒕比较两种DNA快速测序的方法，包括方法的原理和优缺点。 答：目前应用的两种快速序列测定技术是Sanger等（1977）提出的双脱氧法（酶法）及Maxam