大肠杆菌表达重组蛋白的超声破碎及纯化

一 可溶性蛋白的纯化 （一）菌体的破碎

1. 仪器与材料：-80℃冰箱；超声波细胞破碎仪；50mM PBS或50mM Tris-HCl pH

7.5；50ml 离心管；冷冻高速离心机 2. 方法 2.1反复冻融

2.1.1收集菌液500ml，等分10份，4000 r/min 4℃离心15min，弃上清。 2.1.2 菌体沉淀中加入相同菌液体积的50mM PBS 或50mM Tris-HCl（选择使蛋白稳定的缓冲液和pH）重悬洗涤一次。

2.1.3 然后按原菌液体积的1/4加入缓冲液重悬菌体，并加入蛋白酶抑制剂PMSF和EDTA(带His标签不加)，PMSF终浓度为100μg/ml, EDTA的终浓度为0.2mM（约为58μg/ml） 。取20μl重悬菌液进行电泳，检测蛋白表达的情况（是否表达，是可溶性表达还是包涵体表达）。

2.1.4 将菌液（经检测有表达）在-80度冰冻，室温融解，反复冻融三次，由于细胞内冰粒形成和剩余细胞液的盐浓度增高引起溶胀，使细胞结构破碎。

2.2 超声波处理 (对超声波及热敏感的蛋白慎用)

2.2.1 将反复冻融的菌液（必要时可加入1mg/ml 溶菌酶，缓冲液pH＞8.0，加入后需静置20min），进行超声破碎，超声条件：400W，工作5秒，间隔5秒，重复一定次数，直至菌体溶液变清澈为止。

2.2.2 取少量经超声破碎后的菌液，10000rpm离心10分钟，分别对上清和沉淀进行检测，并用全菌作为阳性对照，检测菌体破碎程度及目标条带占总蛋白的含量。 注意事项：

（1） 超声破碎具体条件可根据实验情况而定，要掌握好功率和每次超声时间，降低蛋白被降解的可能。

（2） 功率大时，每次超声时间可缩短，不能让温度升高，应保持在4度左右，超声时保持冰浴。

（3）菌体破碎后总蛋白浓度的测定可用Bradford 法或者紫外吸收法。 （4）可通过SDS-PAGE 电泳观察菌体破碎程度及目标条带占总蛋白的含量。 2.3 GST融合蛋白的纯化

以PGEX融合表达载体表达的GST融合蛋白，可用谷胱甘肽－亲和层析介质纯化。GE公司的谷胱甘肽亲和介质是用10个碳原子连接臂和谷胱甘肽作为配体连接到4%交联的琼脂糖凝胶上，专门用于纯化谷胱甘肽S-转移酶（GST）融合蛋

白、其它的谷胱甘肽转移酶以及与谷胱甘肽有亲和作用的蛋白的亲和色谱填料。

1．GE公司谷胱甘肽填料的性质： 基质 吸附载量 亲和填料的颗粒大小 最大流速 pH范围 使用温度 保存温度 保存液体 化学稳定性

2 缓冲液及样品准备

2.1 缓冲液 Binding Buffer ：PBS pH 7.3

( 140mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 1.8 mM KH2PO4)

Elution Buffer：50 mM Tris-HCl ,10 mM 还原型谷胱甘肽，pH 8.0

注：如有需要，结合及洗脱液中可加入1-10 mM DTT 2.2 样品

样品上柱前要于10000rpm 下离心10分钟或经0.45μm的滤膜过滤后才能上样。如果进行批量纯化时可不必过滤。若样品黏度较大，可用结合缓冲液适当稀释。 3 批量纯化 3.1 介质的准备

(1) 取1mlGST琼脂糖凝胶制成50%混悬液

(2) 用移液管转移到离心管里500×g 离心5min，小心倾去上清。 (3) 加入5ml PBS 混匀介质进行洗涤。

(4) 500×g 离心5min 沉淀介质，小心倾去上清。 (5) 重复洗涤一次。 3.2 批量纯化

(1) 向GST琼脂糖凝胶里加入细胞裂解液（根据目的蛋白表达量和介质的吸附容量决定上样量），轻轻混匀，使GST融合蛋白与还原型谷胱甘肽的充分结合，4度旋转孵育3小时（可进行实验确定）。

4%的交联琼脂糖凝胶 10mg GST融合蛋白/ml 90μm 450cm/h 3-12 常温 +4~30℃ 20%乙醇 室温1M乙酸盐，6 M盐酸胍条件下稳定1h 实验过程中，可根据填料的吸附容量决定上样量，根据填料的其他特性保存填料

(2) 用吸管将混合物转移到另一离心管中，

(3) 500×g 离心5min 沉淀介质，小心倾去上清，取20μl上清液（即流穿液）进行SDS-PAGE以分析介质的结合效率。 (4) 加入5ml PBS 混匀，洗涤。

(5) 500×g 离心5min 沉淀介质，小心倾去上清（洗涤液），取20μl上清液SDS-PAGE分析。 (6) 重复步骤4、5两次。

(7) 加入0.5ml Elution Buffer，轻轻混匀，室温孵育20min。 (8) 500×g 离心5min 沉淀介质，小心收集上清（洗脱液）。

(9) 重复步骤4、5两次，分别检测三次洗脱上清中目的蛋白的含量，根据结果合并含量较多的上清液。 3.3 注意事项

(1) GST融合蛋白与还原型谷胱甘肽的结合比较缓慢，为了获得最大的结合量，很重要的一点就是保证足够作用时间。不同的GST融合蛋白结合效率会有很大不同。

(2) 对不同GST融合蛋白，洗脱体积和洗脱时间会有所不同，可能会需要更高浓度的还原型谷胱甘肽。如果需要的话，需要对流穿液、洗涤液及洗脱液进行SDS-PAGE以及Western blot分析。

(3) GST融合蛋白的浓度可以通过bradford法或紫外分光光度法来确定。如果用Lowry 或者BCA分析，样品需要先利用脱盐柱或超滤进行缓冲液交换处理或透析处理。以除去其中的还原型谷胱甘肽，因为还原型谷胱甘肽的存在会干扰BCA和Lowry测定。

(4) GST琼脂糖凝胶能否重复利用要根据样品来定，而且只能用来处理同一种样品，以防止交叉污染。 4 柱纯化 4.1 装柱

(1) 所有试剂耗材的温度应调整到纯化时的温度。

(2) PBS脱气后从柱底下出口管朝柱内注入，使柱底全部充满水而不留气泡，柱底预留10%柱体积的缓冲液，关闭柱下端出口。

(3) 将洗好的介质用PBS重悬成60%的混悬液，轻轻搅动凝胶溶液，使形成均一的薄胶浆，并立即倒入层析管内，让加入的凝胶在柱内自然沉降。 (4) 立刻将层析柱用PBS缓冲液充满，装好柱上端接口并连接上蠕动泵。 (5) 打开柱子下端出口，并调高泵的流速为15ml/min，让介质在不高于1bar(0.1Mpa)的恒定压力下压紧。

(6) 当柱床体积恒定不变后继续以相同流速至少平衡3个柱床体积，并标记柱床

高度（纯化过程中流速不得超过压紧介质流速的75%）。

(7) 停止蠕动泵，柱内液面缓慢下降，直到稍高于凝胶界面，关闭柱下端出口。柱下端出口连接上细塑管。 4.2 柱纯化

(1) 介质平衡：用10倍柱床体积的Binding Buffer 平衡柱子，流速1ml/min。或一直平衡直到紫外检测仪基线走平。

(2) 上样：关紧螺旋夹，用毛细吸管小心吸去凝胶层面上的缓冲液至凝胶层面与缓冲液液面齐平。将样品离心或过滤后，用吸管小心沿柱壁缓缓加入柱内。轻开螺旋夹，使柱中缓冲液缓缓流出，让样品溶液进入凝胶，至与凝胶层面齐平。柱壁用少量PBS缓冲液小心洗涤2-3次，重复至使缓冲液液面与凝胶层面齐平。 (3) 洗杂：上样后用8倍柱床体积的Binding Buffer冲洗层析柱，流速1ml/min或用Binding Buffer一直冲洗到流出液中无杂蛋白流出，取20μl流穿液进行SDS-PAGE分析介质的结合效率。

(5) 洗脱用5-10倍柱床体积的Elution Buffer洗脱GST融合蛋白，流速1ml/min，收集洗脱峰。取20μl洗脱液进行SDS-PAGE分析其纯度。

(6) 成功的纯化洗脱液中蛋白纯度应该96％，蛋白浓度应该在2mg/ml以上。 4.3 注意事项

(1) GST融合蛋白与还原型谷胱甘肽的结合比较缓慢，为了获得最大的结合量，很重要的一点就是保证足够作用时间，而流速是影响GST融合蛋白与色谱填料结合的关键因素之一，所以必须在上样时维持较低的流速。蛋白的特性、结合pH 及温度也是影响结合容量的因素。

(2) 对不同的GST融合蛋白，洗脱体积和洗脱时间会有所不同，可能会需要更高浓度的还原型谷胱甘肽。如果需要的话，需要对流穿液、洗脱液进行SDS-PAGE以及Western杂交分析。

(3) GST融合蛋白的浓度可以通过其在280nm下的吸光度测定，0.5mg/ml 的GST融合蛋白A280约为1。

(4) GST融合蛋白的浓度也可以通过标准色谱法来确定。如果用Lowry 或者BCA分析，样品需要先利用HiTrap脱盐柱进行缓冲液交换处理或者是透析处理。以除去其中的还原型谷胱甘肽，因为还原型谷胱甘肽的存在会干扰测定。此时可用bradford法。

(5) GST琼脂糖凝胶能否重复利用要根据样品来定，而且只能用来处理同一种样品，以防止交叉污染。

5 再生、清洗 5.1清洗

(1)除去因离子交换作用吸附的蛋白，用2-3倍柱床体积2M 的NaCl溶液清洗柱子，然后用5倍柱床体积的PBS缓冲液清洗。

(2)除去蛋白沉淀、变性蛋白，用2倍柱体积的6 M盐酸胍清洗，然后用5倍柱床体积的PBS缓冲液清洗。

(3)除去强的疏水性蛋白和脂质等，用4倍柱床体积的70%的乙醇或者2倍柱体积1% Triton X-100洗柱子，然后用5倍柱床体积的PBS缓冲液洗涤。

2.4 His标签融合蛋白的纯化（Ni－金属亲和层析法） 1．简介

其原理是利用蛋白质表面的一些氨基酸，如组氨酸能与多种过渡金属离子Cu2+，Zn2+，Ni2+，Co2+，Fe3+发生特殊的相互作用，偶联这些金属离子的琼脂糖凝胶就能够选择性地分离出这些含有多个组氨酸的蛋白以及对金属离子有吸附作用的多肽、蛋白和核苷酸。半胱氨酸和色氨酸也能与固定金属离子结合，但结合力要远小于组氨酸残基与金属离子的结合力。

基质 配基 吸附载量 填料的颗粒大小 推荐流速 化学温度性 pH范围 保存温度 保存液体

2 缓冲液及样品准备

2.1 缓冲液 Binding Buffer：20mM PBS，0.5M NaCl，20-40mM 咪唑 pH 7.4

Elution Buffer：20mM PBS，0.5M NaCl，250-500mM 咪唑 pH 7.4

注：1 所用试剂及水要高纯度，用前0.45μm滤膜过滤。

2 结合缓冲液中加入咪唑可以提高his-tagged 蛋白的纯度。但是要小心不要在洗涤时把目的蛋白洗脱下来。

3 结合及洗脱液中咪唑浓度因分离蛋白的不同而不同，要获得高纯度，咪唑浓度应优化。 2.2 样品处理

6%的交联琼脂糖凝胶 Ni2+ 40mg His-标签 蛋白/ml 90μm <150 cm/h 0.01M HCl 0.1M NaOH 40℃ 一周 2%SDS 1h 30% 异丙醇 30min 3-12 4- 30℃ 20% 乙醇 1）样品上柱前要离心并过滤后才能上样。样品要完全溶解，避免阻塞柱子。 2）如果样品不是用结合缓冲液溶解的，就要调整到相应的盐浓度及pH，或用脱盐柱更换缓冲液并且样品中要加入和结合缓冲液中同浓度的咪唑。 3 批量纯化 3.1 介质的准备

(1) 轻轻颠倒盛有Ni-琼脂糖凝胶的容器，量取2ml匀浆到离心管中。 (2) 500×g 离心5min，沉淀介质。

(3) 小心吸去上清后向介质中加入蒸馏水洗涤。 (4) 轻轻摇动3min，500×g 离心5min 沉淀介质。 (5) 用结合缓冲液重复洗涤一次。

(6) 将介质转移到量筒中，加入适量结合缓冲液制成50%混悬液，混合均匀。 3.2 批量纯化

(1) 每1ml混悬液中加入4ml样品，每1ml 50%混悬液可以结合20mg his-标签蛋白。室温轻摇1h。

(2) 用吸管将混合物转移到一离心管中，

(3) 500×g 离心5min 沉淀介质，小心倾去上清，取20μl上清液（流穿液）SDS-PAGE分析介质的结合效率。 (4) 加入5ml 结合缓冲液混匀，洗涤。

(5) 500×g 离心5min 沉淀介质，小心倾去上清（洗涤液），取20μl上清液SDS-PAGE分析。 (6) 重复步骤4、5两次。

(7) 加入0.5ml Elution Buffer，轻轻混匀，室温孵育5-10min。 (8) 500×g 离心5min 沉淀介质，小心收集上清（洗脱液）。

(9) 重复步骤4、5两次，分别检测三次洗脱上清中目的蛋白的含量，根据结果合并含量较多的上清液。 4 柱纯化 4.1 装柱

(1) Ni琼脂糖凝胶在20%乙醇中预溶胀，小心倾去乙醇，加入蒸馏水制成50%匀浆。所有试剂耗材的温度应调整到纯化时的温度。 (2) 连接好柱子，有必要的话柱子上可连接储液槽。

(3) 用蒸馏水冲洗柱下端，柱底预留10%柱体积的蒸馏水，关闭柱下端出口。 (4) 用玻璃棒引流连续不断将匀浆注入层析管，静置30min，让加入的凝胶在柱内自然沉降。打开柱下端出口，当液面降到稍高于柱床时，关闭出口。 (5) 将上液流接头充满结合缓冲液，与蠕动泵连接后另一端放到柱床顶部（小心气泡）。

(6) 打开柱下端出口同时以1ml/min冲压柱子，再以4.5ml/min冲压柱子。随着柱床顶部的下降，下调上液流接头。

(7) 当柱床高度恒定后，持续以相同流速冲压3个柱床体积，标记柱床高度。 (8) 停止蠕动泵，关闭柱出口，连接层析系统开始平衡柱子。 4.2 柱纯化

(1) 用5-10倍柱床体积的Binding Buffer 平衡柱子，流速1ml/min。或一直平衡直到紫外检测仪基线走平。

(2) 关紧螺旋夹，用毛细吸管小心吸去凝胶层面上的缓冲液至凝胶层面与缓冲液液面齐平。将样品离心或过滤后，用吸管小心沿柱壁缓缓加入柱内。轻开螺旋夹，使柱中缓冲液缓缓流出，让样品溶液进入凝胶，至与凝胶层面齐平。 (3) 柱壁用少量Binding Buffer小心洗涤2-3次，重复至使缓冲液液面与凝胶层面齐平。

(4) 上样后用5-10倍柱床体积的Binding Buffer冲洗层析柱，流速1ml/min或用Binding Buffer一直冲洗到流出液中无杂蛋白流出，取20μl流出液SDS-PAGE分析介质的结合效率。

(5) 用Elution Buffer洗脱，流速1ml/min，收集洗脱峰。可进行线性洗脱或分步洗脱。分步洗脱时Binding Buffer需要5倍柱床体积，线性洗脱时则需要20倍柱床体积。取20μl洗脱液SDS-PAGE分析其纯度。 4.3 注意事项

(1) 结合条件为中性或偏碱性pH(pH7-8)、0.5-1M NaCl、PBS缓冲液。Tris-HCl也经常用到，但是当目的蛋白与镍柱亲和作用弱时，应避免使用。

(2) 结合缓冲液中应避免有螯合剂EDTA、柠檬酸等存在。有必要时可在样品溶液中添加少量。

(3) 如果重组his-tagged蛋白为包涵体，可用6M盐酸胍、8M脲溶解，缓冲液中也可加入变性剂，样品中含脲时，可直接sds-page分析，含盐酸胍时则不能。 (4) 洗脱时可用咪唑，也可用其他方法或方法组合来洗脱：降低pH和提高离子强度。

(5) 如果蛋白对低pH 敏感，可将低pH 洗脱的蛋白溶液每1ml收集到含60-200μl 1M Tris-HCl pH 9.0的管里，洗脱蛋白将以中性条件保存。 (6) EDTA、EGTA也可洗脱，但是会把金属离子从介质上剥落。 (7) 氯化铵和组氨酸也可用于洗脱。

(8) 当需手动测量蛋白吸光值时，可用洗脱缓冲液作空白。 (9) 洗脱蛋白液中咪唑需除去时，可用脱盐柱。

(10) 通常条件下Ni2+的脱落很低，在极端条件下使用时，可在上样前先blank run来降低Ni2+的脱落。

空白循环 :结合和洗脱缓冲液中不含还原剂。 A 用5倍柱体积的蒸馏水冲洗柱子。 B 用5倍柱体积的洗脱缓冲液冲洗柱子。 C 用10倍柱体积的结合缓冲液平衡柱子。 5 再生、清洗 5.1 凝胶的再生

(1)一般进行过5-7次纯化后必须将胶再生。用5倍体积的20mM PBS，0.5M NaCl，50mM EDTA pH 7.4淋洗柱子，再用至少5倍体积的结合缓冲液洗掉残留的EDTA，随后用5倍体积的蒸馏水淋洗。

(2)将0.5体积的0.1M NiSO4上柱，然后用5倍体积的蒸馏水淋洗，随后用5倍体积结合缓冲液淋洗。 5.2 在位清洁

1、除去因离子交换作用吸附的蛋白，用2-3倍柱床体积1.5M 的NaCl溶液淋洗柱子，再用几倍体积的蒸馏水淋洗。

2、除去蛋白沉淀、疏水性蛋白、脂蛋白，用1M的NaOH 以100cm/h的速度淋洗柱子1-2h。再用10倍体积的结合缓冲液淋洗，随后用10倍体积的蒸馏水淋洗。 3、除去强的疏水性蛋白和脂质等，用5-10倍柱床体积的70%的乙醇或者30%的异丙醇洗柱子15-20min，再用10倍体积的蒸馏水淋洗。

二 包涵体蛋白的纯化 1 菌体的破碎

1.1仪器与材料：超声波细胞破碎仪；20mM PBS或20mM Tris-HCl pH 7.5；裂解液bufferA；溶菌酶10mg/ml；50ml ，15ml离心管；冷冻离心机 1.2 方法

(1) 收集菌液500ml，等分10份，4000 r/min 4℃离心15min，弃上清。 （2）菌体沉淀中加入相同菌液体积的20mM PBS 或20mM Tris-HCl（选择使蛋白稳定的缓冲液和pH，一般为7.5-8.0），重悬洗涤2-3次，弃掉上清。 （3）然后沉淀按原菌液体积每500ml以15ml预冷的裂解液bufferA重悬。(有的文献为每克湿菌加4ml -10ml裂解液)

（4）每毫升悬液中加入100μl 10mg/ml溶菌酶（即溶菌酶终浓度1mg/ml）。在冰上孵育15min

（5）对15ml悬液进行超声破碎，超声条件：400W，工作5秒，间隔5秒，重复一定次数。超声破碎时保持冰浴。具体条件可根据实验情况而定。 （6） 4℃，4000 rpm/min离心20分钟所得沉淀即为包涵体。

注意事项：融合蛋白的分子量如果大于150KD时，用超声波破碎很容易将目标蛋白打碎而造成降解，故可用溶菌酶先做处理. 2 包涵体的洗涤

(1) 将包涵体沉淀重悬于含有适量脲（1-4M）的Buffer A中，每克湿重加4-6ml洗涤液。

(2) 超声波处理5秒打碎沉淀，继续用注射器吸入并挤出悬液，重复数次，4℃涡旋悬液30min。或者高速搅拌悬液10min。 (3) 4℃，4000 rpm/min离心15分钟。 (4) 重复上述操作2次至上清液透明无色。

(5) 将包涵体沉淀重悬于Buffer A，4℃，4000 rpm/min离心15分钟，弃掉上清。

BufferA 50mM Tris-HCl pH 8,

0.2mM EDTA, 100mM NaCl,

1% Triton x-100 （或2% 脱氧胆酸钠） 1mM DTT 100μg/ml PMSF

溶菌酶 10mg/ml

注意事项：

(1) 包涵体洗涤时增加NaCl浓度到0.5M，有助于包涵体中杂蛋白的溶解。 (2) 经提取洗涤后得到的包涵体，由还原SDS-PAGE电泳结合光密度扫描可知包涵体中目标蛋白的含量。

(3) 包涵体洗涤是纯化极为重要的一步，不同培养条件下收集的菌液经洗涤可得到不同的纯度。

(4) 用通常的洗涤方法，如果包涵体达不到所需的纯度，可试用分级沉淀法初纯包涵体，步骤如下：

1) 菌体破碎后将所得的包涵体悬浮于含6mol/L盐酸胍的Buffer A中，4℃涡旋悬液30min ，4000r/min离心20min，上清进行分级沉淀。

2) 取一小部分上清用Buffer A稀释到盐酸胍浓度为4 M，然后4℃涡旋悬液15min，静置30min，4000r/min离心20min，上清继续稀释到3M，重复上面操作一直到2M，把每次沉淀和上清跑SDS-PAGE电泳分析，看目标蛋白在哪个盐酸胍浓度下纯度最高。

3) 摸索好条件后，直接将剩余上清直接用Buffer A稀释到所需的盐酸胍浓度，

然后4℃涡旋悬液15min，静置30min，4000r/min离心20min，沉淀既为分级沉淀后的包涵体。

（三）纯化蛋白的纯度分析（SDS-PAGE）

带GST标签可溶性蛋白纯化后的纯度应该在96％，带His标签可溶性蛋白纯化后的纯度应该在90％左右，纯化后的包含体的纯度应该在85％以上才可进行动物免疫。具体SDS-PAGE操作步骤见SOP文件

（四）蛋白质浓度测定

蛋白质浓度测定方法很多，每种方法都有其自身的优点和缺点以及适用范围，不同的实验条件下得到的蛋白测定浓度需要根据纯化蛋白缓冲体系选择合适的测定方法。

一、考马斯亮蓝法（bradford法）

本法主要用来检测经谷胱甘肽亲和层析柱纯化后蛋白浓度j# +j1:9n （一）实验原理 考马斯亮蓝法（bradford法），是根据蛋白质与染料相结合的原理设计的。考马斯亮蓝G-250染料，在酸性溶液中与蛋白质结合，使染料的最大吸收峰的位置由465nm变为595nm，溶液的颜色也由棕黑色变为蓝色。染料主要是与蛋白质中的碱性氨基酸（特别是精氨酸）和芳香族氨基酸残基相结合。在595nm下测定的吸光度值A595，与蛋白质浓度成正比。 /&BIe` bradford法的突出优点是： ~G_Z~ | （1）灵敏度高%w

（2）测定快速、简便，只需加一种试剂。完成一个样品的测定，只需要5分钟左右。

（3）干扰物质少。如干扰lowry法的K+、Na+、Mg2+离子、tris缓冲液、糖和蔗糖、甘油、巯基乙醇、EDTA等均不干扰此测定法。 za1z:+t 此E t~-

（1）由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此bradford法用于不同蛋白质测定时有较大的偏差，在制作标准曲线时通常选用G—球蛋白为标准蛋白质，以减少这方面的偏差。 # b6r\\NO （2）仍有一些物质干扰此法的测定，主要的干扰物质有：去污剂triton x-100、十二烷基硫酸钠（SDS）和0.1M的NaOH。k%{n*

（3）标准曲线也有轻微的非线性，因而不能用beer定律进行计算，而只能用标准曲线来测定未知蛋白质的浓度。 +

法

的

缺

点

是

： （二）试剂与器材 6 1. 试剂： Q*H@::

（1）标准蛋白质溶液，用 G—球蛋白或牛血清清蛋白(BSA)，配制成1.0mg/ml。 （2）考马斯亮蓝G—250染料试剂：称100mg考马斯亮蓝G—250，溶于50ml 95%的乙醇后，再加入120ml 85%的磷酸，用水稀释至1升。 SY0;.Rg 2. 器材： =A7zUj g

（1）可见光分光光度计 bZ!?4 （2）旋涡混合器 CV|h6-# （3）试管16支 = HB!9 （三）操作方法 |O{!=r 1. 标准方法$t

（1）取13支试管，1支作空白，其余试管分为两组，分别加入样品、水和试剂，即用1.0mg/ml的标准蛋白质溶液给各试管分别加入：0(空白)、0.01、0.02、0.04、0.06、0.08、0.1ml，然后用无离子水补充到0.1ml。最后各试管中分别加入5.0ml考马斯亮蓝G—250试剂，每加完一管，立即在旋涡混合器上混合（注意不要太剧烈，以免产生大量气泡而难于消除）。2U:X}

（2）加完试剂2-5分钟后，即可开始用比色皿，在分光光度计上测定各样品在595nm处的光吸收值A595，空白对照为第1号试管，即0.1ml H2O加5.0ml 考马斯亮蓝G—250试剂。 NI S3*

注意：不可使用石英比色皿（因不易洗去染色），可用塑料或玻璃比色皿，使用后立即用少量95%的乙醇荡洗，以洗去染色。塑料比色皿决不可用乙醇或丙酮长时间浸泡。 H （3）另取O.1mL未知浓度的蛋白溶液同上测定。cL!3(In?

（4）用标准蛋白质量（mg）为横座标，用吸光度值A595为纵座标，作图，即得到一条标准曲线。由此标准曲线，根据测出的未知样品的A595值，即可查出未知样品的蛋白质含量。 NL9V@

0.5mg牛血清蛋白/ml溶液的A595约为0.50。 {\\?8Zk7 2. 微孔板法 2.1 操作步骤

(1)完全溶解蛋白标准品，取10μl稀释至100μl，使用浓度为0.5mg/ml。蛋白样品在什么溶液中，标准品也宜用什么溶液稀释。但是为了简便起见，也可以用0.9%NaCl或PBS稀释标准品。

(2)将标准品按0，1，2，4，8，12，16，20μl加到96孔板的标准品孔中，加标

准品稀释溶液补足到20μl。

(3)加适当体积样品到96孔板的样品孔中，加标准品稀释液到20μl。

(4)各孔加入200μl G250染色液，室温放置3-5分钟。

(5)用酶标仪测定A595，或560-610nm之间的其它波长的吸光度。 (6)根据标准曲线计算出样品中的蛋白浓度。

2.2 注意事项

(1)G250染色液使用前请颠倒3-5次，混匀。

(2)蛋白标准请在全部溶解后先混匀，再稀释成一系列不同浓度的蛋白标准。 (3) 将G250染色液回复到室温再使用，有利于提高检测的灵敏度。

(4)需可检测560-610nm之间波长的酶标仪一台，最佳检测波长为595nm。并需96孔板。

(5) G250染色液4℃保存；蛋白标准-20℃保存

(6)灵敏度高，检测浓度下限达到25μg/ml，最小检测蛋白量达到0.5μg，待测样品体积为1-20μl。在50-1000μg/ml浓度范围内有较好的线性关系。

(7) Bradford法测定蛋白浓度不受绝大部分样品中的化学物质的影响。样品中β-巯基乙醇的浓度可高达1M，二硫苏糖醇的浓度可高达5mM，但受略高浓度的去垢剂影响。需确保SDS低于0.01%，Triton X-100低于0.05%，Tween20，60，80低于0.015%。含去垢剂的样品推荐使用BCA蛋白浓度测定试剂盒。 (8) 戴一次性手套操作。、} % 二、紫外吸收法

本法主要用于粗略的蛋白浓度的测定NHF1l}* 1. 优点：

1.1 紫外吸收法简便、灵敏、快速，不消耗样品，测定后仍能回收使用。 1.2 低浓度的盐，例如生化制备中常用的（NH4）2SO4等和大多数缓冲液不干扰测定。特别适用于柱层析洗脱液的快速连续检测 。 2. 缺点：

2.1 测定蛋白质含量的准确度较差，干扰物质多，在用标准曲线法测定蛋白质含量时，对那些与标准蛋白质中酪氨酸和色氨酸含量差异大的蛋白质，有一定的误差。故该法适于用测定与标准蛋白质氨基酸组成相似的蛋白质。

2.2 若样品中含有嘌呤、嘧啶及核酸等吸收紫外光的物质，会出现较大的干扰。核酸的干扰虽然可以适当的校正，但是因为不同的蛋白质和核酸的紫外吸收是不相同的，虽然经过校正，测定的结果还是存在一定的误差。 fVr)CI >Q9

2.3 进行紫外吸收法测定时，由于蛋白质吸收高峰常因pH的改变而有变化，因此要注意溶液的pH值，测定样品时的pH要与测定标准曲线的pH相一致. 3. 280nm和260nm的吸收差法 核酸对紫外光有很强的吸收，在280nm处的吸收比蛋白质强10倍（每克），

但核酸在260nm处的吸收更强，其吸收高峰在260nm附近。核酸260nm处的消光系数是280nm处的2倍，而蛋白质则相反，280nm紫外吸收值大于260nm的吸^*,G

纯蛋白质的光吸收比值：A280/A260= 1.8 :Ds=#w 2:{ 纯核酸的光吸收比值： A280/A260 = 0.5 ;Scf%t_}

测定：含有核酸的样品蛋白质溶液，可分别测定其A280和A260，由此吸收差值，用下面的经验公式，即可算出蛋白质的浓度。 '?I[`+ 蛋白质浓度(mg/ml)=1.5×A280－0.75×A260 4gn 三 BCA法

本法在本实验室中主要用于细胞或组织裂解液，纯化的抗体，纯化后的包涵体或其他无干扰的蛋白溶液的测定 1、适用范围

(1) 标准检测：10～1200ug/ml (2) 微量检测：0.5～10ug/ml 2、原理

在碱性环境下蛋白质分子的肽键结构能于Cu2+络合生成结合物，同时将Cu2+还原成Cu+。而BCA试剂可敏感特异地与Cu+结合，形成稳定的有颜色的复合物，在562nm处有高的光吸收值。颜色的深浅与蛋白质浓度呈正比，可根据吸收值的大小来计算蛋白质的含量。 3、试剂

(1) 试剂A, 1L

取10g BCA (二喹啉甲酸)，4g NaOH，20g Na2CO3·H2O，9.5g NaHCO3与1.6g Na2C4H4O6(·H2O) (酒石酸钠) 加水至1L，用NaOH或固体NaHCO3调PH至11.25。 (2) 试剂B, 50ml 2g CuSO4·5H2O加双蒸水至50ml。

试剂A和试剂B在室温下至少稳定12个月，并可购买商品化试剂(Pierce，货号)。 (3) 标准工作试剂 (SWR)

50份试剂A，1份试剂B，可稳定一周。 4、操作步骤（pierce公司试剂盒）

(1) 标准品溶液的配制：结晶牛血清白蛋白，预先经凯氏定氮法测定蛋白含量，配制成2mg/mL的母液，根据下表配制标准品。 标准品编号 BSA的终浓度(mg/mL) A 2 B 1.5 C 1 D 0.75 E 0.5 F 0.25 G 0.125 收

值

。

通

常

：

3xr H I 0.25 0

(2) 将25μL的标准品及样品与200μL的SWR混合。 (3) 37℃孵育30分钟，冷至室温.

(5) 在570nm读取光密度（OD）值。

(6) 以OD570为横坐标，标准蛋白浓度为纵坐标，绘制标准曲线。根据标准曲线计算样品的蛋白浓度。 5 注意事项

(1) 在低温条件或长期保存出现沉淀时，可搅拌或37oC温育使溶解, 如发现细菌污染则应丢弃。

(2) 样品中若含有EDTA、EGTA、DTT、硫酸铵、脂类会影响检测结果，请试用Bradford法测定蛋白浓度；高浓度的去垢剂也影响实验结果，可用TCA沉淀去除干扰物质。

(3) 要得到更为精确的蛋白浓度结果，每个蛋白梯度和样品均需做复孔, 每次均应做标准曲线。

(4) 当试剂A和B混合时可能会有浑浊，但混匀后就会消失，工作液在密闭情况下可保存1周。 F7