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对化学性肝损伤有辅助保护功能评价方法（修订稿）

保健食品评价试验项目、试验原则及结果判定 Items, Principles and Result Assessment

1试验项目

动物实验分为方案一（刀豆蛋白A急性肝损伤模型）、方案二（急性酒精性肝损伤模型）和方案三（亚急性酒精性肝损伤模型）三种 1.1 方案一（刀豆蛋白A急性肝损伤模型） 1.1.1体重

1.1.2血清中谷丙转氨酶（ALT） 1.1.3血清中谷草转氨酶（AST） 1.1.4血清中乳酸脱氢酶（LDH） 1.1.5 肝组织病理学检查

1.2 方案二（急性酒精性肝损伤模型） 1.2.1体重

1.2.2血清甘油三酯（TG）

1.2.3血清极低密度脂蛋白（VLDL） 1.2.4肝组织病理学检查

1.3 方案三（亚急性酒精性肝损伤模型） 1.3.1体重

1.3.2血清中胆固醇（CHOL） 1.3.3血清中低密度脂蛋白胆固醇(LDL) 1.3.4血清中胆红素（TBIL） 1.3.5肝组织病理学检查

2 试验原则

2.1所列指标均为必做项目。

2.2根据受试样品作用原理的不同，方案一、方案二和方案三任选其一进行动物实验。

3 结果判定

方案一（刀豆蛋白A急性肝损伤模型）在模型成立的前提下，ALT、AST和LDH中任两项血液生化指标阳性和病理结果阳性，可判定受试样品对化学性肝损伤有辅助保护功能。

方案二（急性酒精性肝损伤模型）：血清中TG、VLDL指标阳性和病理组织学检查结果阳性，可判定该受试样品具有对急性酒精性肝损伤有辅助保护功能功能。

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方案三（亚急性酒精性肝损伤模型）：① 血清中CHOL、LDL和TBIL三项检测指标结果阳性，可判定该受试样品具有对亚急性酒精性肝损伤有辅助保护功能作用；② 血清中CHOL、LDL和TBIL三项指标中任两项结果阳性，且肝脏病理组织学检查结果阳性，可判定该受试样品具有对亚急性酒精性肝损伤有辅助保护功能功能。

在急性或亚急性酒精性肝损伤结果判定中，任何一项方案为阳性时，可认为该受试物具有降低酒精性肝损伤危害功能。

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对化学性肝损伤有辅助保护功能检验方法

Method for the Assessment of Assisting the Protection Against

Chemical Injury of Liver Function

1 方案一（刀豆蛋白A急性肝损伤模型） 1.1 原理

刀豆蛋白A(concanavalin A,ConA)是一种在人体内对肝细胞有特异性毒性作用的植物凝集素，它能在体外激活T细胞的丝裂原，进入循环后首先活化T淋巴细胞，继而激活肿瘤坏死因子（TNF）和白介素2等细胞因子，引发炎症反应，可诱导淋巴细胞、巨噬细胞的细胞毒作用，通过肝细胞凋亡等多种途径损伤肝细胞。 1.2实验动物

成年大鼠或小鼠，单一性别，大鼠（180-220克），每组8-12只；小鼠（18－22克），每组10-15只。 1.3 实验方法 1.3.1 剂量和分组

至少设三个剂量组，同时设阴性对照组和模型对照组，必要时设溶剂对照组。以人体推荐量的10倍(小鼠)或5倍(大鼠)一个剂量（等效应剂量），另设二个剂量组，最高剂量不得超过人体推荐量（以公斤计算）的30倍。 1.3.2受试样品的给予

经口灌胃给予受试样品，无法灌胃时将受试样品掺入饲料或饮水亦可，并记录每只动物的饲料摄入量或饮水量。原则上连续给予30天，必要时可延长至45天。 1.3.3实验步骤 1.3.3.1造模方法

每日经口灌胃给予受试样品，阴性对照组和模型对照组给予纯净水。将动物每周称重两次，以调整受试样品剂量。模型组及各样品组于实验结束时一次尾静脉给予剂量为15～20mg/kg的刀豆蛋白A，小鼠10ml/kg BW，禁食8h后经腹腔注射60mg/kg BW的戊巴比妥钠溶液麻醉，腹主动脉采血，并取肝组织，进行各项指标的检测及病理组织学检查。 1.3.3.2检测指标

体重、血清中谷丙转氨酶（ALT）、血清中谷草转氨酶（AST）、血清中乳酸脱氢酶（LDH）、肝脏病理组织学变化。

1.4 血清ALT、AST和LDH的测定 1.4.1检测方法

血清中ALT、 AST 推荐采用速率法，

LDH推荐采用乳酸为底物的速率法（LD-L法）。

血样离心（2500rpm）后取上清，血清中的ALT、AST和LDH的检测采用用全自动或半自动生化分析仪进行。 1.4.2 数据处理

数据采用方差分析，但需按方差分析的程序先进行方差齐性检验。方差齐，计算F值，

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F值＜F0.05，各组均数间差异无显著性；F值＞F0.05，用多个实验组和一个对照组间均数的两两比较方法进行统计。对非正态或方差不齐的数据进行适当的变量转换，待满足正态或方差齐要求后，用转换后的数据进行统计；若变量转换后仍未达到正态或方差齐的目的，改用秩和检验进行统计。 1.4.3 结果判定

模型对照组与阴性对照组比较，血清ALT、AST和LDH含量升高有统计学意义（P＜0.05），表示模型成立。在模型成立的前提下，受试样品组血清ALT、AST和LDH含量与模型对照组比较降低，差异有显著性（P＜0.05），可分别判定ALT、AST和LDH指标结果阳性。

1.5 肝脏病理组织学检查 1.5.1 实验材料

取小鼠肝脏左叶用10%福尔马林固定，从肝左叶中部做横切面取材，常规病理制片（石蜡包埋，HE染色）。 1.5.2镜检

从肝脏的一端视野开始记录细胞的病理变化，用5倍物镜连续观察整张组织切片，可见肝脏多发的灶状、片状坏死。 1.5.3 评分标准

肝细胞坏死： 大致正常 偶见坏死细胞 坏死细胞小于整个视野的1/4 坏死细胞占整个视野的1/4～1/2 坏死细胞占整个视野的1/2～3/4 坏死细胞弥漫整个视野 1.5.4 数据处理

采用方差分析或秩和检验。但方差分析需按方差分析的程序先进行方差齐性检验，方差齐，计算F值，F值＜F0.05，各组均数间差异无显著性；F值＞F0.05，用多个实验组和一个对照组间均数的两两比较方法进行统计。对非正态或方差不齐的数据进行适当的变量转换，待满足正态或方差齐要求后，用转换后的数据进行统计；若变量转换后仍未达到正态或方差齐的目的，改用秩和检验进行统计。 1.5.5 病理结果判定

模型对照组与阴性对照组比较肝细胞坏死程度加重有统计学意义（P＜0.05），表示模型成立。在模型成立的前提下，受试样品任何一个剂量组与模型对照组比较，肝细胞坏死程度减轻，有统计学意义（P＜0.05），可判断为阳性结果。 1.6 结果判断

在模型成立的前提下，ALT、AST和LDH中任两项血液生化指标阳性和病理结果阳性，可判定受试样品对化学性肝损伤有辅助保护功能。

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