DNA）扩增产物。

(二)、多重PCR(Multiple PCR)

在同一PCR反应体系中用多对引物(覆盖不同长度的靶序列)同时扩增。例如用多重PCR进行DNA缺失筛选

(三)、套式PCR(nested PCR)

用第一次PCR扩增区域内部的第二对(套式)引物对第一次PCR产物再次扩增，可以增加特异性和灵敏度。 (四)、非对称PCR(asymmetric PCR)

在PCR反应体系中，限制引物之一的浓度(50－100:1)进行扩增，可得到单链PCR产物，可用于制备单链测序模板或单链DNA杂交探针。

mRNA差异显示（mRNA differential display）：这是建立在基因差异表达的理论基础上，通过比较不同的个体，或是同一个体的不同组织，甚至不同的发育阶段之间的mRNA种类的差异，利用随机引物，用反转录PCR技术发展出来的一种分离产物未知基因的一种方法，简称DDRT-PCR。 RACE（rapid amplification cDNA ends）：是一种通过PCR进行cDNA末端快速克隆的技术（始于80年代末）。是以mRNA为模板反转录成cDNA第一条链后用PCR技术扩增出某个特异位点到3’或5’端之间未知序列的方法。 三、PCR与突变检测

通过PCR扩增片段的多态性分析有助于检测各种突变。 PCR扩增产物的多态性可分为三种类型：

1、限制性片段长度多态性(Restriction fragment length polymorphism，RFLP)； 2、序列多态性(Sequence polymorphism)； 3、长度多态性(Length polymorphism) (一)、PCR-RFLP分析

设计适当的扩增引物，使扩增片段包括某一或数个多态性的限制性内切酶识别序列，在PCR扩增后用该限制酶切割PCR产物，根据电泳后酶切片段长度变化，即可作出诊断，该方法主要用于检测各种已知突变。

(二)、PCR结合ASO探针杂交分析

ASO(Allele specific oligonucleotide)探针：等位基因特异性寡核苷酸探针，指针对各种正常和突变靶序列设计的特异性寡核苷酸探针。 1、PCR产物变性后斑点印迹至膜上，用一系列AS0探针杂交，严格控制杂交和洗膜条件、确保正常ASO探针只与正常靶序列条交，而突变ASO只与含相应突变碱基的靶序列杂交。

2、另一种方法是将ASO探针固定在膜上，然后与生物素标记的PCR产物杂交-反向斑点杂交(reverse dot－blot)，这样一次杂交可完成多个探针检测。

上述方法适用于基因组中某些固定位点上的已知序列差异的检测，如癌细胞中的ras突变，HLA typing等。 (三)、等位基因特异性扩增(Alleles specific amplification，ASA)又称扩增阻碍突变系统(Amplification refractory mutationsystem，ARMS)

利用PCR引物的3?端末位碱基必须与其模板DNA互补才能有效扩增的原理，设计等位基因特异性PCR扩增引物，在严格的条件下，只有在引物3?碱基与模板配对时才能出现PCR扩增带，从而检测出突变，该法省去了探针杂交操作。 (四)、PCR-SSCP分析

单链DNA在中性条件下，由于碱基配对等分子内相互作用而具有复杂的折叠构象，在聚丙烯酰胺凝胶电泳中，其迁移率除与长度有关外，还与其构象有关。DNA的突变造成DNA片段中碱基序列不同，变性为单链后在中性聚丙烯酰胺凝胶中的构象不同—单链构象多态性(Single strand conformation polymorphism，SSCP)，利用迁移率的差别可使各种序列不同的单链得以分离。

PCR-SSCP的步骤：PCR扩增→产物热变性成单链→非变性PAGE→显示(放射自显影或银染等) PCR－SSCP是检测点突变的简便灵敏方法，已用于多种遗传病、肿瘤中原癌基因和抑癌基因的突变分析，

对＜200bp片段其灵敏度较好，靶序列增长时其灵敏度下降(一般175～345nt)。 (五)、扩增片段长度多态性(Amp-FLP)

VNTR、STR等重复序列，因重复单位数目的不同而呈现高度多态。因此利用重复序列两侧的特异性引物进行PCR扩增，所得扩增片段具有高度多态性，这些不同长度的等位片段可用PAGE分离。 (六)、PCR直接测序（DNA sequencing，DS）

DNA序列分析是检测基因突变最直接最可信的方法，它不仅可确定突变的部位，还可确定突变的性质。PCR直接测序是指对PCR产物直接进行序列分析，而不是先将DNA待测片段克隆于测序载体上，这可大大的简化操作步骤。

PCR产物测序常采用循环测序法(cycle sequencing)：在PCR反应体系中同时将ddNTP加入，并利用同位素或荧光素标记的引物引导扩增，使模板的扩增与测序同时进行。应用PCR测序有以下优点：模板需要量小；方法简便，易自动化；测序效率高。 四、PCR在基因诊断中的应用 (一)、遗传病的基因诊断

目前已有近百种遗传病可用PCR技术进行诊断和产前诊断。用PCR对遗传病进行诊断的前提是对致病基因的结构必须部分或全部清楚。如利用PCR-RFLP或Amp-FLP对遗传病家系进行连锁分析，进而作出基因诊断。

(二)、传染病诊断

PCR已应用于多种病原体的特异性检测和鉴定 1、病毒：如HBV，HCV，HIV，HPV等。

2、致病菌：如淋球菌、结核杆菌、军团菌、幽门螺杆菌、肺炎支原体等； (三)、肿瘤基因诊断

1、原癌基因和抑癌基因突变，如ras，p53；癌基因扩增和表达分析。 2、利用微卫星不稳定性，直接诊断肿瘤，如膀胱癌等；

3、分析白血病(如CML)中异常染色体易位，检测微小残留病变(Minimal residual disease，MDR) 4、肿瘤多药耐药性(multi-drug resistance，MDR)检测 5、端粒酶活性检测 第三节基因芯片技术

基因芯片(Gene chip/DNA chip)又称为DNA微矩阵(DNA Microarray)，是包被在固相载体上的高密度DNA的微阵列。 一、基因芯片的类型：

1、寡核苷酸芯片：采用固相原位合成技术制备的，或用传统方法合成后再固定于芯片上的寡核苷酸探针阵列(Gene chip，Affymatrix，Inc)。

2、DNA微矩阵(DNA Microarray)：将DNA探针通过自动化点样技术固定于特定的固相支持物如玻璃表面，然后再与靶序列杂交。 二、基因芯片技术的原理

DNA芯片技术是将许多特定的寡核苷酸片段或基因片段有规律地排列固定于支持物(如膜、硅片或玻璃片)上，然后通过类似核酸杂交的的方法与待测的标记样品按碱基配对原则进行杂交，再通过检测系统对其进行扫描，并用相应软件对信号进行比较和检测，得到所需的生物信息。其特点是可进行基因的高通量、大规模、平行化、集约化的信息处理和功能研究。 用DNA微矩阵进行基因表达分析的步骤

1、分离(待比较的)不同组织或细胞的mRNA，逆转录法制备带不同荧光标记的cDNA探针； 2、混合探针，并与microarray杂交，洗涤除去未结合探针。

3、用特有波长的激光扫描芯片，并用共聚焦显微镜检测各探针的荧光，各element的相对荧光强度反映特异mRNA的相对丰度。 三、基因芯片技术的应用

1、疾病诊断(遗传病、肿瘤和病原体诊断)

2、新药筛选和毒理学研究

3、突变/多态性检测单核苷酸的多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)。 4、基因表达分析 5、发现新基因

四、表达谱基因芯片的特点及其应用

利用基因芯片可进行高通量基因表达平行分析，是基因功能研究的重要手段。对来源于不同个体(正常人与患者)、不同组织、不同细胞周期、不同发育和分化阶段、不同病变、不同刺激(包括不同诱导、不同治疗阶段)下的细胞内的mRNA或逆转录后产生的cDNA与表达谱基因芯片进行杂交，可以对这些基因表达的个体特异性、组织特异性、发育阶段特异性、分化阶段特异性、病变特异性、刺激特异性进行综合的分析和判断，迅速将某个或几个基因与疾病联系起来，极大地加快这些基因功能的确立，同时进一步研究基因与基因间相互作用的关系。

采用表达谱基因芯片研究基因表达与传统的NorthernBlot相比有许多重要的优点： 1、检测系统的微型化，对样品等需要量非常小。

2、同时研究上万个基因的表达变化，研究效率明显提高。

3、能更多地揭示基因之间表达变化的相互关系，从而研究基因与基因之间内在的作用关系。 4、检测基因表达变化的灵敏度高，可检测丰度相差几个数量级的表达情况。 5、节约费用和时间。