并没有整合到基因组上。这些在细胞核内处于非整合状态的DNA可维持数天之久，而且转染后72小时内能与内源基因一同进行表达与调节。我们称这样的基因表达为瞬时表达，它可用来鉴定同适当报告基因融合的克隆基因启动子的关键性调节元件。 周质（periplasm）：系指在大肠杆菌一类的革兰氏阴性细菌中，位于内膜和外膜之间的细胞结构部分。在基因工程研究工作中，大肠杆菌的细胞周质是外源克隆基因表达蛋白质产物的重要场所。

HAT选择法：是一种选择含重组体细胞的方法。HAT是TK+培养基中次黄嘌呤（hypoxanthine）、氨基

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蝶呤（aminopterin）和胸苷（thymidine）头一个字母的合称。采用TK细胞突变株作为受体细胞。选择原理：用氨基蝶呤（APT）处理细胞，可抑制二氢叶酸还原酶，导致从dUMP合成TTP，dATP，dGTP的合成过程受阻断。次黄嘌呤是dATP，dGTP补救合成途径的底物，细胞借助次黄嘌呤可绕过APT继续

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合成dATP，dGTP，胸苷激酶则可由培养集中的外源胸苷合成TTP，因此TK+的细胞得以存活，而TK

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细胞死亡。TK的细胞中如转染进TK+基因则继续存活。由此可选择含TK+的重组体细胞。

第九章基因诊断

基因诊断是通过检测基因的存在状态或缺陷对疾病作出诊断的方法。 基因诊断的主要技术： 1．核酸分子杂交

2．聚合酶链反应(PCR) 3．基因芯片技术

第一节核酸分子杂交技术

核酸杂交(Nucleic acid hybridization)是指具有一定同源性的两条单链核酸在一定条件下，按碱基互补的原则重新配对形成双链的过程。 一、核酸杂交的基本原理

DNA的变性和复性：在一定的条件(如适当的温度、有机溶剂存在等)下，DNA的双链可解开成为单链，这一过程称为DNA的变性(Denaturatioin)。高温、低盐和有机溶剂促进DNA变性。Tm值是反映DNA的热稳定性的一个参数，称为DNA的熔化温度，系指一半的双链DNA解离成为单链时的温度。DNA的热稳定性或Tm值直接与其碱基组成特别是GC碱基对含量有关，GC碱基对含量越高，Tm值也越高。 DNA的杂交即复性(Renaturation)是变性的单链DNA在一定的条件下(低于Tm的温度下)与其互补序列退火形成双链的过程，因此杂交与Tm值相关。 影响杂交的主要因素：

温度：一般在低于Tm约15至25度的温度下杂交速率最快。

盐浓度：钠离子增加杂交分子的稳定性，降低钠离子浓度强烈地影响Tm值和复性速率。但当钠离子浓度超过0.4M时，对复性速度和Tm值影响不大。

甲酰胺：有机溶剂如甲酰胺能减少双链核酸的稳定性。每增加1%的甲酰胺，DNA/DNA或DNA/RNA双链的Tm值减少0.72℃。常用50%甲酰胺。

硫酸葡聚糖：使杂交速率增加，但有时可能增加杂交本底。 二、核酸探针的选择和标记

核酸探针是指能与待检测的靶核酸序列互补杂交的某种已知核酸片段，它必须具有高度的特异性，并且带有某种适当的标记以便被检测。 (一)、核酸探针的类型

1．克隆的DNA片段，常用cDNA探针。

2．RNA探针(Riboprobe)：一类具有标记的用于探测反应的RNA分子，特指为RNA探针。制备过程：首先将目的cDNA克隆到含病毒RNA聚合酶启动子的质粒载体上，然后加入病毒RNA聚合酶，从而使标记的核苷酸分子掺入到转录产生的RNA转录本上，即形成RNA探针，最后将这些探针纯化出来供检测反应使用。RNA探针的优点是特异性高；杂交效率(灵敏度)更高。适合于Northen杂交、原位杂交等。主要缺点是不稳定，易被降解，另外其制备较困难。

3．寡核苷酸探针可用化学方法人工合成，制备较方便，但灵敏度稍差。

4．聚合酶链反应扩增产物是很好的探针来源，其优点是制备和标记相对容易。 (二)、核酸标记的类型

放射性同位素，目前应用最广，优点是灵敏度高，特别适用于单拷贝基因或低丰度mRNA检测，缺点是易造成放射性污染以及半衰期短，使用不便。 核酸探针标记常用的同位素有以下几种：

1．32P：其放射性强，自显影时间短，灵敏度较高，缺点是半衰期短(14.3天)，放射线散射较严重，因此对分辩率有影响。

2、35S：放射性较低，半衰期长(87.1天)，灵敏度较高；低散射，因此在用Ｘ－光片自显影时分辩率高，特别适用于核酸序列分析和原位杂交等实验。

3、33P：是一种较理想的同位素，它的放射性较低，灵敏度高，分辩率好，半衰期也较长(25.4天)，适用范围较广。但价格偏高。

非同位素标记：常用地高辛或生物素系统。

优点：无放射性污染，较稳定；缺点：灵敏度、特异性稍差。 (三)、核酸探针的标记

1、随机引物法(Random priming)

随机引物是人工合成的含有各种可能的排列顺序的六核苷酸片段的混合物，因此可以与任何核酸片段杂交，并作为聚合酶反应的引物。标记酶：大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ的大片段——klenow片段。 特点：所得探针的放射性比活较高，适用于大多数杂交。

2、缺刻平移法(Nick translation)：是一种制备具有高比活性的，用于Southern、Northern blotting以及cDNA文库筛选的cDNA探针的技术。首先用有限浓度的Dnase使cDNA片段形成缺口，然后再用DNA聚合酶在缺口处开始标记DNA分子。

标记酶：大肠杆菌DNaseⅠ(极微量)和DNA聚合酶Ⅰ。 用缺刻平移法制备的探针较短，较适合于原位杂交。 3、RNA探针的制备和标记

RNA探针可用RNA聚合酶体外转录法制备。该方法的合成效率高，所得产物大小均一，有较高的比活，特异适合于Northern杂交和原位杂交。 4、聚合酶链反应标记DNA探针

利用TaqDNA聚合酶和标记的dNTP，sk以少量的起始模板合成高比活的c双链或单链DNA探针。 5、寡核苷酸探针的标记

5?-端标记：T4多核苷酸激酶标记法，一般用于制备DNA序列分析时用的5?-标记的寡苷酸引物。 3?-端标记：末端核苷酸转移酶法，32P-dNTP或ddNTP。

6、非同位素核酸探针标记：地高辛或生物素标记的核酸探针的制备方法和同位素探针相似。但是不能用多核苷酸激酶标记法直接对5?-端进行非同位素标记。 三、常用核酸杂交技术

滤膜杂交是指先将待检测的核酸序列结合到适当的固相支持物如尼龙膜上，然后与存在于溶液中的已标记探针进行杂交的过程。 滤膜杂交的基本过程为： 1、核酸探针的制备和标记； 2、核酸片段的凝胶电泳分离；

3、将凝胶中的核酸片段通过印迹(blot)转移到某种固相支持物上； 4、用标记的探针与被固定的靶核酸序列杂交(通常还包括预杂交)； 5、洗膜(除去未杂交的游离探针等)；

6、检测带标记的杂交分子(放射自显影或酶联反应)。

(一)、斑点／狭缝印迹(Dot/slot blotting)杂交：DNA或RNA样品经变性后直接点样于尼龙膜上，然后进行杂交和检测。其优点是简单、迅速，可同时做多个样品；缺点是特异性不好，有一定比例的假阳性，此外，靶核酸的分子大小难于判断。

(二)、Southern印迹：指将经过电泳分离的DNA片断转移到一定的固相支持物的过程。 Southern印迹杂交的步骤如下：

1、用限制性内切酶消化大分子DNA；

2、用琼脂糖凝胶电泳对DNA片段按分子量大小分离；

3、将DNA片段在琼脂糖凝胶电泳中变性成单链后，再转移到适当的固相支持物上并与之结合； 4、探针与膜上的DNA杂交； 5、检测。

Southern印迹杂交主要用于基因组结构分析、基因组DNA的定性和定量分析以及利用限制性片段长度多态性进行基因突变分析等。

(三)、Northern印迹：是指RNA经变性凝胶电泳后，将其转移到固相支持物上，以便用杂交反应检测特定的mRNA分子的含量与大小。是基因表达研究分析的标准方法。 Nothern印迹的基本过程包括： 1、RNA的提取； 2、RNA变性电泳； 3、RNA转移和固定； 4、杂交； 5、检测。

除RNA的提取和变性胶电泳与DNA不同外，其余基本与Southern印迹相同，关键是减少实验中的RNA酶污染。

(四)、核酸杂交在基因诊断中的应用

通过核酸杂交技术，可以利用带有某种标记的已知核酸片段作为探针，去检测未知核酸序列。因此，核酸杂交可用于基因鉴定和基因突变分析等领域。 1、限制性片段长度多态性(RFLP)分析

多态性(polymorphism)指基因组中特定基因座位(DNA序列)存在两种或两种以上状态(等位基因)，并且其中任何一个等位基因在人群中的频率不低于1%。换言之，低于1%则视作点突变。

限制性片段长度多态性(RFLP)是由于DNA变异(产生新的酶切位点或消除原有的酶切位点)导致在限制性核酸内切酶酶切时产生不同长度的片段。可借助southern blotting或PCR的方法进行检测

RFLP分析与遗传病基因诊断。人类染色体VNTR序列的RFLP分析图谱：DNA fingerprinting。 2、等位基因特异性寡核苷酸(ASO)探针杂交

寡核苷酸中的碱基错配会大大影响杂交分子的稳定性，因此可用人工合成的针对正常和突变等位基因的特异性寡核苷酸探针进行杂交，检测点突变。 3、基因表达分析

常用Northern blotting或原位杂交分析。 第二节聚合酶链反应(PCR)技术 一、PCR的基本原理 (一)、PCR的基本过程

PCR是一种体外扩增特异DNA片段的技术。它包括下列三个基本步骤： 1、变性(Denaturation)：待扩增的DNA模板加热变性成单链；

2、退火(Annealing)：降低温度，使单链靶序列与寡核苷酸引物退火；

3、延伸(Extension)：在适当条件下，利用DNA聚合酶使引物延伸，产生新的双链。

上述变性、退火、延伸步骤的重复循环，导致特异的靶序列的指数扩增。PCR产物是介于引物的5?端之间的双链DNA片段。

(二)、PCR体系中的主要成份 1、TaqDNA聚合酶

是一种耐热的DNA聚合酶，具有5?-3?DNA聚合酶活性，一般有5?-3外切酶活性，有或无3?-5?外切酶活性(校对活性)，无校对活性的酶在PCR中错掺率较高。PCR中Taq酶的用量一般为0.5～2.5U，过多

易造成非特异性扩增，过少可能灵敏度不够。

2、寡核苷酸引物是决定PCR扩增特异性的关键。 引物（primer）：1）在DNA复制过程中由RNA聚合酶按DNA模板合成的一段特异的RNA短序列，它为DNA聚合酶加入核苷酸提供一个游离的3’-OH末端，从而使链不断延长，这段引物最后被删除掉，出现的缺口由DNA聚合酶封闭。2）具有游离的3’-OH末端及特定序列的寡核苷酸短片段，退火到DNA模板之后启动聚合酶链式反应。 设计PCR引物时的几条原则：

①引物长度一般15～30碱基，过短则特异性低； ②避免内部二级结构；

③G/C和A/T碱基均匀分布，G/C含量在45%～55%之间；

④两个引物(特别是3?端)间不能发生互补，以免形成引物引物二聚体；

⑤引物的3?-端碱基一般应与模板严格配对，并且3?端为G、C或T时引发效率较高；

⑥引物的5?-端可添加与模板无关的序列(如限制性内切酶的识别位点、ATG起始密码子或启动子序列等) PCR中所用引物浓度一般在0.1～0.5uM，太高的引物浓度易造成非特异性扩增，太低会降低合成效率。合成的引物5?为羟基，没有磷酸基团。如果需要您可以用多核苷酸激酶进行5'端磷酸化。 3、MgCl2

Mg2+浓度除影响Taq酶活性外，还影响双链DNA的Tm值，因而影响PCR的特异性和扩增效率。PCR中的最适MgCl2浓度一般为1.5～2.5mM(注意游离Mg2+浓度还与能结合Mg2+的化合物如dNTP、EDTA等的浓度有关。

4、脱氧核苷三磷酸(dNTP)一般采用均衡的dNTP浓度，4种dNTP各为200umol/L，dNTP可减少游离Mg2+，因此影响聚合酶活性和引物退火。

5、模板单、双链DNA，以及RNA经逆转录合成的cDNA。

PCR样品可以是粗制品，但不应含有核酸酶和蛋白酶及其它干扰Taq酶活性的抑制剂。 引物/模板的比率影响PCR的特异性。 (三)、PCR循环参数

1、预变性(Initial denaturation)

模板DNA完全变性对PCR能否成功至关重要，一般95℃加热3～5分钟。 2、引物退火(Primer annealing)

退火温度一般需要凭实验(经验)决定。退火温度对PCR的特异性有较大影响。 3、引物延伸

引物延伸一般在72℃进行(Taq酶最适温度)。延伸时间随扩增片段长短而定。 4、循环中的变性步骤

循环中一般95℃，30秒足以使各种靶DNA序列完全变性：变性时间过长损害酶活性，过短靶序列变性不彻底，易造成扩增失败。 5、循环数

大多数PCR含25～35循环，过多易产生非特异扩增。 6、最后延伸

在最后一个循环后，反应在72℃维持5～15分钟，使引物延伸完全，并使单链产物退火成双链。 (四)、PCR中的污染和假阳性 PCR中污染主要来自 1、样品间交叉污染；

2、先前PCR产物遗留(carry-over) 二、几种常用特殊PCR技术

(一)、逆转录PCR(Reverse transcription－PCR，RT-PCR)

RNA经逆转录后可作为PCR的模板。逆转录PCR(RT－PCR)常用于基因表达研究(定量PCR)和逆病毒检测。设计RT－PCR引物时，应使引物分别位于不同的外显子中，以便区别cDNA和gDNA（基因组