ABCD人民医院检验科 PCR室作业指导书 主题内容
PE5700核酸扩增荧光仪操作维护程序 文件编号：ABCD-3-PR-21 版本/修订号：A/0 生效日期：20060808 第 37 页 共90 页 PE 5700型核酸扩增荧光仪操作维护程序
1．目的：使PE 5700型核酸扩增荧光检测仪能够正确和正常的使用，保证扩增及结果分析的标准化、规范化。 2．适用范围：PE 5700型核酸扩增荧光检测仪。 3．负责人： 操作人： 4. 性能参数:见说明书。 5. 操作程序：
5．1 扩增反应前须先在PE5700 SDS 软件的设置面板上按照事先排好的标本位置进行设置。每次实验除了待检标本，还要包括一个阴性对照、一个阳性对照、一个阳性室内质控品、一组阳性标准品（4个梯度10、10、10、10）。
5．2 依次打开电脑显示器和电脑主机的电源开关，进入Windows NT界面。 5．3 接着打开光源检测器和PCR仪电源开关，预热5分钟。 5．4 点击PE 5700 SDS 图标，打开软件。
5．5 在New plate Application 窗口分别选定5700/SYBR Green， 然后单击OK，打开一空白设置面板。 5．6 在Setup 版面设定样品种类与名称，数量。
5．6．1 在Type栏中选择类别：STND－标准梯度，UNKN－未知样品， NTC－阴性对照，Not in use－未使用 5．6．2 再在Name栏中依次输入样品名称。
5．6．3 在框定所选标准梯度孔数后，需在工具栏中单击P窗口，选定PR1 primer SYBR后，关闭窗口，可见所选孔左下角有一长方形阴影。
5．6．4 在框定所选孔数后，在工具栏中单击Q窗口，即可在此窗口输入定值标准品的标准量。 5．7 点击Instrument 即可在此窗口设定循环参数。
5．8 选定任务栏File中的Save项，弹出对话框。在对话框中的File Name项下输入一组数字和（或）字母组成的文件名，选Save。
5．9 检查设置正确与否，运行程序
5．9．1 在设置完程序文件的Instrument窗口，点RUN键，即可运行。 5．9．2 反应结束后，选任务栏File中的Save项，保存实验结果。 5．10 关闭PE 5700 序列检测器开关，再关扩增仪开关。 5．11 结果分析标准程序：
对于5700结果曲线的分析，应按以下步骤进行：全部曲线——阴性对照——阳性对照——阳性室内质控
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ABCD人民医院检验科 PCR室作业指导书 主题内容 PE5700核酸扩增荧光仪操作维护程序 文件编号：ABCD-3-PR-21 版本/修订号：A/0 生效日期：20060808 第 38 页 共90 页 品——阳性标准品——逐个分析（标出阳性标本和可疑标本）——调整参数，获得较好的标准曲线，显示定量结果——登记，发报告。
5．11．1 整体曲线的观察,将所有曲线选中进行整体观察.
a)观察是否存在污染情况（包括标本污染和试剂污染），特别应注意大量曲线在同一Ct值出现上涨的情况。
b)观察是否有光路传导阻滞或电压波动等机器原因形成的异常曲线。 5．11．2 阴性对照的分析
阴性对照：试剂中加入与待检标本进行同样处理的已知阴性标本。 作用：用以监测实验室和前处理过程中是否存在污染。 5．11．3 阳性对照的分析
阳性对照：试剂中加入与待检标本进行同样处理的已知阳性标本。 作用：用以监测实验能否正常检出阳性标本，避免假阴性的出现。 5．11．4 阳性室内质控品的分析
阳性室内质控品：试剂中加入与待检标本进行同样处理的已知或未知浓度的阳性室内质控血清。 作用：用以监控日常实验的精密度。 5．11．5 阳性标准品的分析
a)各梯度曲线的分布是否均匀，若各梯度曲线均未分开，则表明阳性标准品稀释可能存在问题，提示实验中存在较大人为误差。
b)观察各曲线的Ct值是否在平日的正常位置：
情况1：若出现低拷贝标准品做不出，而各曲线Ct 值均后移，则判断是否为试剂扩增效率下降（如试剂过期或保存条件不合格）。
情况2：出现低拷贝标准品做不出，而高拷贝曲线Ct值均正常，则提示可能存在低拷贝阳性标准品的降解情况。
c) 每日必做10标准品，用作以下三方面监控：
一 是否存在操作误差，如加样量过少等原因导致10标准品未能检出； 二 是否存在稀释后的梯度放置过久，低拷贝标准品降解的情况；
三 若高拷贝标准品出现Ct值后移，且能排除情况A、B，则判断是否为试剂灵敏度下降。 5．11．6 单个曲线的判断
逐个分析每条曲线，判断曲线的阴阳性或属可疑曲线。（可疑标本是指曲线在27个Ct值后出现上涨且平台趋势不明显或上涨幅度比较低的标本。可疑标本要第二天重做，两次结果一致则报阳性，否则结果报阴性。）曲线观察内容：在基线选择2～8时观察△Rn值大小（是否有三期特征）。在基线选择0～0时观察Rn值曲线形状。
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ABCD人民医院检验科 PCR室作业指导书 主题内容 PE5700核酸扩增荧光仪操作维护程序 5．11．7 得出定量结果
文件编号：ABCD-3-PR-21 版本/修订号：A/0 生效日期：20060808 第 39 页 共90 页 调节基线和阈值以得到一较好的标准曲线。电脑据此曲线给出阳性结果值。此时应排除某些阴性标本因荧光曲线假性上扬而得出的假阳性结果和某些弱阳性标本因终末荧光值过低而显示的假阴性。 5．11．8发放报告
及时登记检测结果记录，发放临床报告。
5.12.维护和校准程序：
5.12．1 微软Windows NT工作站的维护
硬盘驱动器每月29日左右运行一次碎片清除程序，使用Norton Utilities或类似软件。具体步骤： a）放入Norton Utilities光盘。
b）从My Computer打开Norton Utilities软件光盘。 c）启动清理碎片/优化程序。
d）运行完成后，检查以确信无严重错误记录，退出Norton Utilities。 e）取出Norton Utilities光盘，重新启动计算机。 5.12．2 PCR仪的维护 5.12．2．1 样品槽的清洁
样品槽每月进行一次清洁，如出现样品槽污染情况则随时清洁。 操作方法：
a）运行25℃HOLD程序使样品槽温度达到室温。关闭仪器，等待10分钟。 b）从样品槽移去样品架。
c）在样品槽中加入少量浓度≥95%乙醇，用尼龙棉签或塑料杆擦洗反应孔。 d）用干棉签吸干乙醇。
e）在PE 5700光源检测器未盖住样品槽时，打开PCR仪，并升温到50℃运行10分钟，以蒸发掉多余的乙醇。
5.12．2．2 热盖的清洁
热盖每月进行一次清洁，如有需要随时进行。
a）运行25℃HOLD程序使样品槽温度达到室温。关闭仪器，等待10分钟。
b）逆时针旋转PE 5700光源检测器顶部旋钮。向后推PE 5700光源检测器至滑轨距离的大约1/3处。 c）PE 5700光源检测器滑轨上有缺口。从这些缺口垂直抬起PE 5700光源检测器，小心侧放于仪器顶盖上。不要从仪器取走热盖。
d）用经过浓度≥95%乙醇湿润的镜头纸或脱脂棉球清洁加热盖，待干。 e）将PE 5700光源检测器重新安装回滑轨。 5.12．2．3 PE 5700光路系统的维护
ABCD人民医院检验科 PCR室作业指导书 主题内容 PE5700核酸扩增荧光仪操作维护程序 5.12．2．3．1 调准ROI参照条
文件编号：ABCD-3-PR-21 版本/修订号：A/0 生效日期：20060808 第 40 页 共90 页 调准ROI参照条在仪器更换卤素灯、仪器定期校准或仪器维修后进行。不得由一般实验人员进行该项操作。
a）PCR仪样品槽中放入荧光检测板。
b）将PE 5700光源检测器向前拖动盖住样品槽，并旋紧。 c）从Start菜单选择运行PE 5700 SDS管理软件。
d）积分时间从512ms开始，用位置调整点，调节ROI的高度与右边线。 e）逐渐增加积分时间，直到可以看到至少四个块（约4096ms）。 f）调整最左侧位置调整点。
g）减少积分时间到1024ms，调整上方与底部的位置调整点。
h）减少积分时间以便最右侧块可见但未饱和（约512ms），调节最右侧位置调整点。如有需要用右上角拖动点调整图像的倾斜度（以左上角为中心旋转）。 i）调节后的参照条宽度必须在ROI参照块间有小空隙。
5.12．2．3．2 校正ROI光路
ROI光路校正每月进行一次，以便确信结果仍然是优化的。 a）在PCR仪样品槽中放入荧光检测板。
b）将PE 5700光源检测器向前拖动盖住样品槽，并旋紧。 c）从Start菜单选择运行PE 5700 SDS管理软件。
d）点选Show ROI复选框。每个样品孔周围出现一蓝色椭圆圈。 e）点选Show Saturation复选框。
f）设定积分时间为1024ms；打开卤素灯和光闸。
g）点击LIVE按钮获取图像，然后在任何地方左击停止。获取中等程度未饱和图像（无红色图像）。 h）从Edit菜单中选择Calibrate ROIs每个孔都会选取合适的ROI，确定96孔都被蓝色椭圆圈正确界定。
i）图像太亮太暗都会出现错误信息，相应增加或减少积分时间，并重复上述第8步直到无错误信息出现。
j）检查孔ROI位置，所有孔信息都应包含在96个ROI椭圆圈中。如果没有，重复8和9步。
5.12．2．3．3 检查PCR仪样品槽的荧光污染
检查PCR仪样品槽的荧光污染每月进行一次，如有需要随时进行。 a）开启PE 5700型核酸扩增荧光检测仪电源。 b）从Start菜单选择运行PE 5700 SDS管理软件。 c）从样品槽中移去反应板。