红曲Azaphilone化合物分离纯化与体外抗肿瘤活性研究
一、实验目的 （1）学习掌握天然化合物提取和纯化的一般方法（选择性提取、柱分离和结晶等工艺）； （2）学习掌握目标化合物HPLC分析检测方法； （3）学习掌握抗肿瘤活性药物体外筛选方法；
（4）了解从复杂天然产物中制备微量化合物的综合分离纯化技术。
二、实验原理
红曲为红曲霉菌接种于大米经固态发酵培养而成，其生产与应用在我国已有 1000 多年历史。红曲主要用于食品着色、酿酒和传统中药材。红曲霉菌生长过程中产生大量的Azaphilone类代谢产物，由聚酮合成酶（Polyketide Synthases, PKS）代谢途径合成[1-2]。红曲霉菌发酵产品中含有十多种Azaphilone类化合物，其中最主要的是6种色素组分（如图1所示），2种红色素（Rubropunctatamine、Monascorubramine）、2种黄色素（Monascin、Ankaflavin）和2种橙色素（Rubropunctatin、Monascorubrin）。现代药理学研究表明azaphilone类化合物对鞘氨醇激酶、脂肪酸合成酶、端粒酶、gp120-CD4、Grb2-SH2和p53-MDM2等三大疾病(癌症、爱滋病和心血管疾病)相关的关键酶蛋白具有重要的生物活性作用[3-4]。不同红曲色素组分的生物活性，如黄色素的治疗代谢综合症[5]和抑癌[6-8]作用已引起国内外学者的广泛重视。
上述6种色素组分在化学结构和理化性质上十分相似，分离纯化较为困难。张慧娟[9]
采用二次薄层层析法分离纯化红斑红曲素，钟立人[10]采用高效液相色谱研究红曲色素组分的分离，这些方法仅能纯化得到毫克级红曲色素。连喜军[11]采用树脂法分离红曲黄色素和红色素，但各种树脂对红曲色素的吸附量均低于52 U/g。代春华[12]采用硅胶柱层析法分离红曲黄色素，处理量小且较难实现单一组分红曲色素的分离纯化。夏明[13]采用高速逆流色谱分离得到一种黄色素与一种紫红色素，但未能对分离得到的色素组成、纯度和得率做进一步分析。
图1红曲色素的化学结构
中国冠心病二级预防研究（China Coronary Secondary Prevention Study，CCSPS）提供的证据首次显示红曲霉发酵产物血脂康除了具有治疗心血管疾病的药效外，还能有效降低肿瘤死亡危险[14]，与安慰剂组相比，肿瘤发生及因肿瘤死亡的危险性分别降低 36% 和 55%。Hong等[15]研究发现，不仅洛伐他汀及血脂康对结肠癌的原位癌及转移癌细胞有抑制作用，血脂康中去除洛伐他汀后的产物对结肠癌的原位癌及转移癌细胞也有良好的抑制作用，说明血脂康中除洛伐他汀外具有其他抑制肿瘤细胞的有益成分。
Yasukawa[16]等研究发现，M.anka 发酵产物中色素粗提物对12-邻-十四酰-佛波醇-13-乙酸酯（12-O-tetradecanoyl-phorbol-13-acetate，TPA）诱导的致皮肤癌小鼠具有治疗作用，其
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中红曲色素 Monascorubrin 最有效。Akihisa [17]证实口服 Monascin 可以抑制过氧化亚硝酸盐或紫外线诱导的二期皮肤癌。台湾大学农业化学研究所 Su NW[18]研究发现，红曲黄色素 Ankaflavin 对人肝癌细胞 Hep G2 和 A549 具有相近的诱导凋亡作用，采用 MTT 法测定 IC50 为 15 μg/mL，流式细胞仪检测药物作用的细胞发现，sub-G1 峰明显增加，而对正常细胞株 MRC-5 和 WI-38 的生长没有影响。 Ankaflavin 的同系物 Monacin 则没有诱导肝癌细胞凋亡的作用。
红曲Azahpilone化合物抑癌作用的研究已经引起国内外学者的广泛关注。本实验拟采用选择性溶剂提取-柱分离纯化-结晶的组合技术分离纯化6种红曲Azahpilone化合物组分，同时采用MTT法对红曲Azahpilone化合物的体外抗肿瘤活性进行研究。
三、实验方案
1、红曲Azaphilone化合物的提取
比较不同极性溶剂对红曲Azaphilone化合物提取的影响，影响因素涉及：溶剂性质、固液比、温度、提取时间和提取次数等。
2、红曲Azaphilone化合物的分离纯化
（1）粗分离：不同极性溶剂选择性萃取法。
（2）纯化：柱分离法、高速逆流萃取色谱、制备色谱和结晶等。 3、红曲Azaphilone化合物体外抗肿瘤活性研究 （1）细胞培养
细胞培养在含10%小牛血清、100 U /ml青霉素、50 U /ml庆大霉素的RPMI1640培养液内,于37℃、5% CO2 饱和湿度的细胞培养箱内培养,隔天传代。细胞传代培养至细胞处于对数生长期、生长状态良好、约80%贴壁融合时进行试验。
（2）MTT比色法检测红曲Azaphilone化合物对肿瘤细胞增殖的抑制作用
1）取处于对数生长期状态良好的细胞一瓶，胰蛋白酶消化，制成1×105个/mL的细胞悬液。
2）细胞悬液移入96孔板，每孔100μL，周围一圈用PBS填充，置37℃, 5% CO2培养箱中培养24 h。
3）移去旧培养基，加入不同浓度的红曲Azaphilone化合物，每孔100μL，另设空白对照组和阳性对照组，每组设6个复孔。药物作用24 h后，吸弃含药培养基，于每孔中加入无血清、无酚红1640培养基100μL，再加入MTT溶液10μL，继续孵育4 h，终止培养。
4）小心吸弃96孔板孔内上清液，每孔加入150μL DMSO，振荡10 min，于490 nm波长处在酶标仪上测定各孔光吸收值(OD值)，计算细胞的增殖抑制率：抑制率(%)=(1-用药组平均OD值/空白对照组平均OD值)×100%，应用SPSS16.0软件进行数据处理并计算癌细胞增殖的半数抑制浓度(IC50)。
四、实验药品与仪器
1、实验药品：红曲Azaphilone化合物、1640培养基、小牛血清、青霉素、庆大霉素、MTT、DMSO等。
2、实验仪器：HPLC、酶标仪、洁净室、二氧化碳培养箱等。
五、数据记录和结果处理
1、根据HPLC检测谱图分析红曲Azaphilone化合物分离纯化效果； 2、根据MTT检测数据计算红曲Azaphilone化合物抗癌活性。
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六、注意事项：
1、注意有机溶剂和MTT的使用安全； 2、细胞培养时注意无菌操作。
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