PCR扩增反应的操作

第一节PCR扩増反应的基本原理

一、聚合魄式反应(PCR)的基本构成

PCR是聚合酶链式反应的简称，指在引物指导下由酶催化的对特定模板(克隆或基因组 DNA)的扩增反应，是模拟体内DNA复制过程，在体外特异性扩增DNA片段的一种技术，在 分子生物学中有广泛的应用，包括用于DNA作图、DNA测序、分子系统遗传学等.

PCR基本原理：是以单链DNA为模板，4种dNTP为底物，在模板3,末墙有引物存在的情 况下，用酶进行互补链的延伸，多次反复的循环能使微鼠的模板DNA得到极大程度的扩增.在 微量离心管中，加入与待扩增的DNA片段两端己知序列分别互补的两个引物、适量的緩冲液、 微量的DNA膜板、四种dNTP溶液、耐热TaqDNA聚合醇、Mg2件.反应时先将上述溶液加热, 使模板DNA在高温下变性，双链解开为单链状态：然后降低溶液温度,使合成引物在低温下与 其祀序列配对，形成部分双链，称为堰火；再将温度升至合适温度.在Taq DNA聚合酶的催化 下，以dNTP为原料，引物沿方向延伸，形成新的DNA片段，该片段又可作为下一轮反 应的模板，如此重夏改变温度，由高温变性、低温复性和适温延伸组成一个周期，反复循环，使 目的基因得以迅速扩増.因此PCR循环过程为三部分构成：模板变性、引物退火、痢稳定DNA 聚合酶在适当温度下催化DNA链延伸合成(见图)。

1. 模板DNA的变性

模板DNA加热到90^5-C时,双螺旋结构的级键断裂，双链解开成为单链，称为DNA的变 性，以便它与引物结合.为下轮反应作准备。变性温度与DNA中G-C含量有关，GC间由三个 氢键连接，而A-T间只有两个狙键相连.所以Gt含量较高的模板，其解链温度相对要高些. 故PCR中DNA变性需要的温度和时间与模板DNA的二级结构的复杂性、G-C含量高低等均有 关。对于高G_C含量的模板DNA在实验中需添加一定量二甲基亚破(DMSO),并且在PCR循 环中起始阶段热变性温度可以采用97-C,时间适当延长，即所谓的热启动.

2. 模板DNA与引物的退火

将反应混合物温度降低至37-65C时，寡核昔酸引物与单链模板杂交，形成DNA棋板?引物 复合物。退火所需要的温度和时间取决于引物与靶序列的同源性程度及寡核昔酸的碱基组成。一 般要求引物的浓度大大高于棋板DNA的浓度，井由于引物的长度显著短于棋板的长度，因此在 退火时，引物与模板中的互补序列的配对速度比模板之间重新配对成双链的速度要快得多，退火 时间一般为I?2min。

3. 引物的延伸

DNA模板-引物复合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板. 按基困对与半保留复制原理,合成一条与模板DNA鮭互补的新链。重复循环变性-退火?延伸三 过程，就可获得更多的“半保留复制鮭”，而且这种新鮭又可成为下次循环的模板.延伸所需要 的时间取决于模板DNA的长度。在72*C条件下,Taq

DNA聚合醪催化的合成速度大约为

40?60个碱基,秒.经过一轮“变性-退火-延伸”循环，模板拷贝数增加了一倍。在以后的循环中, 新合成的DNA都可以起模板作用，因此每一轮循环以后，DNA拷贝数就増加一倍.每完成一个 循环需2?4min, 一次PCR经过30?40次循环，约2?3丄扩増初期，扩増的量呈直线上升， 但是当引物、模板、聚合酶达到一定比值时.酶的催化反应趋于抱和，便出现所谓的“平台效应” .即爬DNA产物的浓度不再増加.

PCR的三个反应步骤反复进行，使DNA扩増暈呈指数上升.反应最终的DNA扩増量可用 Y= (1+X) ■*计算.Y代表DNA片段扩増后的拷贝数，X表示平(Y)均每次的扩増效率，n 代表循环次数。平均扩増效率的理论值为100%,但在实际反应中平均效率达不到理论值。反应 初期，靶序列DNA片段的増加呈指数形式，随着PCR产物的逐渐积累，被扩増的DNA片段不

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再呈指数増加.而进入観性増长期或静止期，即出现“停滞效应”，这种效应称平台期数、PCR 扩增效率及DNA聚合酶PCR的种类和活性及非特异性产物的竞争等因素.大多数情况下，平台 期的到来是不可避免的。

PCR扩増产物可分为长产物片段和短产物片段两部分.短产物片段的长度严格地限定在两个 引物链5,端之间.是需要扩増的特定片段.短产物片段和长产物片段是由于引物所结合的棋板不 一样而形成的,以一个原始模板为例，在第一个反应周期中.以两条互补的DNA为模板，引物 是从3,端开始延伸.其5,端是固定的.3,端则没有固定的止点.长短不一，这就是“长产物片段\进入第二周期后.引物除与原始棋板结合外，还要同新合成的链（即“长产物片段”）结合。 引物在与新链结合时，由于新链模板的5,端序列是固定的.这就等于这次延伸的片段3,端被固定 了止点，保狂了新片段的起点和止点都限定于引物扩増序列以内、形成长短一致的“短产物片段” .不难看出“短产物片段”是按指数倍数增加，而“长产物片段”则以算术倍数增加，几乎可以 忽略不计.这使得PCR的反应产物不需要再纯化，就能保证足够纯DNA片段供分析与检測用.

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二、PCR疝的五个刑

参与PCR反应的物质主要为五种：引物、酶、dNTP,模板和M叶. I-引物

引物是PCR特异性反应的关键，PCR产物的特异性取决于引物与棋板DNA互补的程度。理 论上.只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其设计互补的寡核甘酸桂做引物，利用PCR就 可将模板DNA在体外大蛍扩増\引物设计有3条基本原则：首先引物与模板的序列要紧密互补. 其次引物与引

物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构,再次引物不能在模板的非目的位点引发 DNA聚合反应（即错配）.

引物的选择将决定PCR产物的大小、位置、以及扩増区域的Tm值这个和扩増物产量有关的 重要物理參数.好的引物设计可以避免背景和非特异产物的产生,甚至在RNA-PCR中也能识别 cDNA或基因组模板。引物设计也极大的影响扩增产量：若使用设计粗槌的引物,产物将很少甚 至没有：而使用正确设计的引物得到的产物量可接近于反应指数期的产量理论值。当然，即使有 了好的引物，依然需要进行反应条件的优化，比如调整M曹愀度,使用特殊的共溶剂如二甲基亚

甲酰胺和甘油。对引物的设计不可能有一种包罗万象的规则确保PCR的成功，但遵循某些 原则，则有助于引物的设计。

<1）引物长度

PCR特异性一殷通过引物长度和退火温度来控制.引物的长度一般为15-3Qbp?常用的是 18?27bp,但不应大于38bp.引物过短时会造成Tm值过低，在酶反应温度时不能与模板很好的 配对；引物

过长时又会造成Tm值过高，超过臨反应的最适温度，还会导致其延伸温度大于74T, 不适于TaqDNA聚合酶进行反应，而且合成长引物还会大大增加合成费用?

（2） 引物碱基构成

引物的G4C含量以40?60%为宜，过高或过低都不利于引发反应，上下游引物的GC含賞 不能相差太大。其Tmttl是寡核昔酸的解链温度，即在一定盐浓度条件下，50%寡核昔酸双链解 链的温度，有效启动溫度，一般高于Tm值5~IOC.若按公式Tm=4 （G+C） +2 （A+T）估计引 物的Tm值，则有效引物的Tm为55?80*C,其Tm值最好接近72\以使复性条件最佳。引物中 四种碱基的分布最好是随机的，不要有聚嗥吟或聚啧噬的存在.尤其3,端不应超过3个连续的G 或C,因这样会使引物在G+C富集序列区错误引发?

（3） 引物二级结构

引物二级结构包括引物自身二聚体、发卡结构、引物向二聚体等.这些因素会影响引物和模 板的结合从而影响引物效率。对于引物的3'末端形成的二聚体，应控制其AG大于.5.0 kcal/mol 或少于三个连续的碱基互补，因为此种情形的引物二聚体有进一步形成更稳定结构的可能性，引 物中间或5,端的要求可适当放寛.引物自身形成的发卡结构,也以3,端或近3,端对引物-模板结 合影响更大：影响发卡结构的稳定性的因素除了碱基互补配对的键能之外，与茎环结构形式亦有 很大的关系.应尽量避免3,末端有发卡结构的引物.

（4） 引物3,端序列

引物3味端和模板的碱基完全配对对于获得好的结果是非常重要的,而引物3味端最后5 到6个核昔酸的错配应尽可能的少.如果3,末端的错配过多,通过降低反应的退火温度来补偿这 种错配不会有什么效果，反应几乎注定要失败。

引物3,末端的另一个问题是防止一对引物内的同源性.应特别注意引物不能互补，尤其是在 3,末端.引物间的互补将导致不想要的引物双链体的出现,这样获得的PCR产物其实是引物自身 的扩增。这将会在引物双链体产物和天然模板之间产生竞争PCR状态，从而影响扩增成功。

引物3,末端的稳定性由引物，末端的碱基组成决定.一般考虑末端5个碱基的AG?AG值是 指DNA双链形成所需的自由能，该值反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性，此值的大小对 扩增有较大

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的影响。应当选用3,端AG值较低（絶对值不超过9）?负值大，则3,末端稳定性高， 扩增效率更高。引物的3,端的AG值过高，容易在错配位点形成双链结构并引发DNA聚合反应.

需要注意的是.如扩增编码区域，引物3,端不要终止于密码子的第3位，因密码子的第3位 易发生简并.会影响扩增特异性与效率。另外末位碱基为A的错配效率明显高于其他3个碱基. 因此应当避免在引物的3'端使用碱基A。

（5） 引物的5,端

引物的5,端限定着PCR产物的长度，它对扩増特异性彫响不大。因此，可以被修饰而不影响 扩增的特异性.引物5,端修饰包括：加酶切位点：标记生物素、荧光、地高辛、E3垸如引入蛍 白质结合DNA序列；引入突变位点、插入与缺失突变序列和引入一启动子序列等.对于引入一 至两个酶切位点，应在后续方案设计完毕后确定，便于后期的克隆实验，特别是在用于表达研究 的目的基因的克隆工作中?

（6） 引物的特异性

引物与非特异扩增序列的同源性不要超过70%或有连续8个互补碱基同源，特别是与待扩增 的棋板DNA之间要没有明显的相似序列。

2. 酶及其浓度

TaqDNA多聚臨是耐热DNA聚合酶，是从水生柄热歯（Thennus aquaticus）中分离的.Taq DNA聚合酶是一个单亚基，分子量为94 000Da.具有5—＞3的聚合酵活力，5」＞3,的外切核酸 酵活力，无3」＞5?的外切核酸酶活力，会在3,末端不依赖模板加入I个脱氧核昔酸（通常为A, 故PCR产物克隆中有与之匹配的T载体），在体外实验中，TaqDNA聚合酶的出错率为叶?1。 %此酶的发现使PCR广泛的被应用。

此酶具有以下特点：

（】）耐高温，在70C下反应2小时后其残留活性在90%以上.在93C下反应2小时后其残 留活性是仍能保持60%,而在95C下反应2小时后为原来的40%。

（2）在热变性时不会被钝化，故不必在扩増反应的毎轮循环完成后再加新醴。 ⑶一般扩増的PCR产物长度可达2.0 kb,且特异性也较高.

PCR的广泛应用得益于此酶,目前各试剂公司中开发了多种类型的Taq酶，有用于长片段扩 増的酶，扩增长度极端可达40kb；有在常温条件下即可应用的常温PCR聚合酶；还有针对不同 实验对象的酶等。

一典型的PCR反应约需的酶量为2.5u （总反应体积为50gl时）’浓度过高可引起非特异性扩 增，浓度过低则合成产物最减少?

3. dNTP的质量与浓度

dNTP的质量与浓度和PCR扩增效率有密切关系，dNTP粉呈颗粒状，如保存不当易变性失 去生物学活性。dNTP溶液呈酸性，使用时应配成高浓度后.以IMNaOH或IMTris. HCI的缓 冲液将其pH调节到7.0?7.5,小量分装，-20*C冰冻保存。多次冻融会使dNTP降解。在PCR反 应中，dNTP应为50?200呻。1/1.尤其是注意4种dNTP的浓度要相等（等摩尔配制），如其中 任何一种浓度不同于其它几种时（偏高或间氐），就会引起错配.浓度过低又会降低PCR产物的 产量.dNTP能与M。+结合，使游髙的Mg?浓度降低。

4. 模板（靶基因）核酸

棋板核酸的量与纯化程度.是PCR成败与否的关键环节之一,传统的DNA纯化方法通常釆 用SDS和蛋白酶K来消化处理标本。SDS的主要功能是：溶解细胞膜上的脂类与蛋白质，因而 溶解脱蛋白而破坏细胞膜,并解离细胞中的核蛋白.SDS还能与蛋白质结合而沉淀■蛋白酶K能 水解消化蛋白质，特别是与DNA结合的组蛋白，再用有机溶剂（酚与氯仿抽〉抽提除去蛋白质 和其它细胞组份.用乙醇或异丙醇沉淀核酸，该核酸即可作为棋板用于PCR反应.一般临床检 測标本，可釆用快速筒便的方法溶解细胞，裂解病原体，消化除去染色体的蛋白质使靶基因游离, 宜接用于PCR扩増.

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模板DNA投入量对于细菌基因组DNA 一般在l~10ng佃，实验中模板浓度常常需要优化， 一般可迭择几个浓度梯度（浓度差以10倍为一个梯度）.在PCR反应中，过高的模板投入：fi往 往会导致PCR实验的失败。

5. M叶浓度

Mg2+对PCR扩増的特异性和产量有显著的彩响.在一般的PCR反应中，各种dNTP浓度为 200呻ol/l时，度为1.5?2.0mmof/l为宜。Mg?+浓度过高，反应特异性降低.出现非特异 扩増，浓度过低会

降低Taq DNA聚合酶的活性.使反应产物减少。一般厂商提供的Taq DNA聚 合酵均有相应的缓冲液，而Mg?他已添加,如果特殊实验应采用无Mg2,的缓冲液,，在PCR反 应体系中添加一定量的Mg2\\

三、PCR反应待点 PCR反应具有以下特点： 1. 强特异性

PCR反应的特异性决定因素为：（1）引物与棋板DNA特异性的结合I （2）碱基配对原则| （3） TaqDNA聚合酶合成反应的忠实性】（4）靶基因的特异性与保守性.

其中引物与模板的正确结合是关键，引物与模板的结合及引物链的延伸是遵循碱基配对原则 的。聚合酶合成反应的忠实性及TaqDNA聚合酶耐高温性，使反应中棋板与引物的结合（复性）可 以在较高的温度下进行，结合的特异性大大増加，被扩増的靶基因片段也就能保持很高的正确度. 再通过选择特异性和保守性高的靶基因区，其特异性程度就更髙\

2. 高灵敏度

PCR产物的生成量是以指數方式增加的，能将皮克（pgFF%〉量级的起始待测模板扩増到 微克（gg=IOGg）水平.能从】00万个细胞中检出一个靶细胞：在病毒的检测中，PCR的灵敏度 可达3个RFU （空斑形成单位由在细菌学中最小检出率为3个细菌。

3. 快速简便

PCR反应用耐高温的TaqDNA聚合繭,一次性地将反应液加好后,叩在PCR仪上进行变性 一退火一

延伸反应,反应一般在2?4小时完成。扩增产物常用电泳分析，操作简单易推广，如 釆用特殊PCR仪（荧光时时定SPCR仪）则可全程监测PCR反应的结果，故耗时将更短.

4. 低纯度模板

不需要分离病毒或细菌及培养细胞，DNA粗制品及总RNA等均可作为扩增模板.可直接用临床 标本如血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等粗制的DNA扩増检测.

第二节PCR扩増反应的实施

一、PCR反应的条件

PCR反应条件为温度、时间和循环次数. 1.温度与时间的设置

基于PCR原理三步骤而设貿变性-退火-延伸三个温度点.在标准反应中釆用三温度点法'双 链DNA在90?95*C变性，再迅速冷却至40?60*C,引物退火并结合到紀序列上，然后快速升温 至70?75C.在TaqDNA聚合酶的作用下.使引物链沿棋板延伸.对于较短靶基因（长度为 100?300bp时）可釆用二温度点法，除变性温度外、退火与延伸温度可合二为一，一般采用 94P变性，65*C左右退火与延伸（此温度TaqDNAB仍有较高的催化活性）。

（I）变性温度与时冋：变性温度低，解链不完全是导致PCR失败的最主要原因。一般情况 下，93C?94T Imin足以使棋板DNA变性，若低于93C则需延长时间，但温度不能过高，因

为高温环境对醇的活性有影响.此步若不能使紀基因模板或PCR产物完全变性，就会导致PCR 失

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败?

（2） 退火（复性）温度与时间：退火温度是影响PCR特异性的较重要因索。变性后温度快 速

冷却至40P?&TC,可使引物和模板发生结合.由于模板DNA比引物复杂得多，引物和棋板 之间的碰撞结合机会远远高于模板互补链之间的碰擅。退火温度与时间,取决于引物的长度、碱 基组成及其浓度，还有靶基序列的长度。对于20个核昔酸，G+C含量约50%的引物，55*C为选 择最适退火温度的起点较为理想。引物的复性温度可通过以下公式帮助选择合适的温度：

Tm 值（解链温度）=4（G+C）+2（A+T） 复性温度=Tm值＜5?10C）

在Tm值允许范围内.选择较髙的复性温度可大大减少引物和模板间的非特异性结合，提髙 PCR反应的特异性。复性时间一般为30?60戏，足以使引物与模板之间完全结合。

（3） 延伸温度与时间* Taq DNA聚合醵的生物学活性：70?80C, 150核昔酸/S博分子】7 or, 60

核昔酸/S/酶分子；55C, 24核昔酸酶分子；高于90C时.DNA合成几乎不能进行。

（4） PCR反应的延伸温度一般选择在70?75C之间，常用温度为72C,过高的延伸温度不 利于引

物和棋板的结合.PCR延伸反应的时间，可根据待扩増片段的长度而定，一般Ikb以内的 DNA片段,延伸时间Imin是足够的。3?4kb的紀序列需3?4min：扩增lOkb需延伸至】5min? 延伸进间过长会导致非特异性扩增带的出现.对低浓度模板的扩增，延伸时间要稍长些?

2. 循环次数

循环次数决定PCR扩増程度。PCR循环次数主要取决于模板DNA的浓度，一般的循环次数 选在30-40次之间，循环次数越多，非特异性产物的量亦随之增多。

二、 PCR扩增沖分析

PCR产物是否为特异性扩増.其结果是否准确可靠，必须对其进行严格的分析与鉴定，才能 得出

正确的结论。PCR产物的分析，可依据研究对象和目的不同而釆用不同的分析方法。

1.

凝胶电泳分析：PCR产物电泳，EB漠乙锭染色紫外仪下观察.初步判断产物的特异性。 PCR

产物片段的大小应与预计的一致，特别是多重PCR,应用多对引物，其产物片断都应符合预 讦的大小,这是起码条件?

（1） 琼脂糖凝胶电泳：通常应用1?2%的琼脂糖凝胶，供检测用.

（2） 聚丙烯酰胺凝胶电泳：6-10%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离效果比琼脂憶好，条带比较集 中，

可用于科研及检测分析。

2. 3. 4.

酶切分析：根据PCR产物中限制性内切酵的位点，用相应的酶切、电泳分离后，获得符 合分子杂交：分子杂交是检测PCR产物特异性的有力证据，也是检测PCR产物碱基突变 的有Southern印迹杂交：在两引物之间另合成一条寡核昔酸链（内部寡核昔酸）标记后做探针 .

理论的片段，此法既能进行产物的鉴定，又能对靶基因分型，还能进行变异性研究。 效方法?

与PCR产物杂交.此法既可作特异性鉴定.又可以提高检测PCR产物的灵敏度，还可知其分 子量及条带形状，主要用于科研.

5. 6.

斑点杂交：将PCR产物点在硝酸纤維素膜或尼膜薄膜上，再用内部寡核昔酸探针杂交， 观核酸序列分析：是检测PCR产物特异性的最可靠方法。

察有无着色斑点,主要用于PCR产物特异性鉴定及变异分析。

三、 PCR结果异常分析

PCR产物的电泳检测时间一殷为48h以内，有些最好于当日电泳检测,大于48h后带型不规 则甚

致消失.

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1. 假阴性，不出现扩増条带

PCR反应的关健环节有：①模板核酸的制备：②引物的质量与特异性；（3）酶的质最及活 性：④PCR循环条件。寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究。

（1） 模板：①棋板中含有杂蛋白质,②模板中含有Taq醸抑制剂；③模板中蛋白质没有 消化除净，特别是染色体中的组蚩白：④在提取制备模板时丢失过多.或吸入酚：⑤模板核酸 变性不彻底。在酶和引物质量好时.不出现扩増带，极有可能是标本的消化处理，模板核酸提取 过程出了毛病，因而要配制有效而稳定的消化处理液，其程序亦应固定不宜随意更改?

（2） 酶失活：需更换新酶，或新旧两种酶同时使用，以分析是否因酶的活性丧失或不够而 导致假阴性.需注意的是有时忘加Taq酶或漠乙锭。

<3）引物：引物质量、引物的浓度、两条引物的浓度是否对称，是PCR失败或扩増条带不 理想、容易弥散的常见原因。有些批号的引物合成质量有问题，两条引物一条浓度高，一条浓度 低，造成低效率的不对称扩增，对策为：

① 选定一个好的引物合成单位。 ②

引物的浓度不仅要看OD值，更要注藏引物原液做琼脂糖凝胶电泳，一定要有引物条带 出

现，而且两引物带的亮度应大体一致.如一条引物有条带，一条引物无条带，此时做PCR有 可能失败，应和引物合成单位协商解决.如一条引物亮度高，一条亮度低，在稀释引物时要平衡 其浓度。

③

引物度高浓度小最分装保存，防止多次冻融或长期放冰箱冷藏部分,导致引物变质降解 失

效。④引物设计不合理，如引物长度不够，引物之何形成二聚体等.

（4） Mg?，浓度：Mg?+离子浓度对PCR扩增效率影响很大，浓度过髙可降低PCR扩增的待 异性，浓度过低则影响PCR扩增产最甚至使PCR扩增失败而不出扩增条带?

（5） 反应体积的改变：通常进行PCR扩増采用的体积为20偽、30卜1、50叫或100囚,用多大 体积进行PCR扩増，是根据科研和临床检测不同目的而设定，在做小体枳如20卩1后，再做大体 积时,一定要模索条件，否则容易失败。

（6） 物理原因：变性对PCR扩増来说相当重要，如变性温度低，变性时间短，极有可能出 现假阴性;退火温度过低,可致非特异性扩増而降低特异性扩増效率退火温度过髙影响引物与模板 的结合而降低PCR扩增效率.有时还有必要用标准的温度计，检测一下扩増仪或水溶铜内的变 性、退火和延伸温度，这也是PCR失败的原因之一.

（7） 靶序列变异：如祂序列发生突变或缺失，影响引物与模板特异性结合.或因靶序列某 段缺失使引物与模板失去互补序列，其PCR扩增是不会成功的。

2. 假阳性

出现的PCR扩增条带与目的靶序列条带一致，有时其条带更整齐，亮度更高。可能的原因 是： （1） 引物设计不合适：选择的扩増序列与非目的扩増序列有同源性，因而在进行PCR扩増 时，扩増出的PCR产物为非目的性的序列.黑序列太短或引物太短.容易出现假阳性.需重新 股计引物.

（2） 靶序列成扩増产物的交叉污染：这种污染有两种原因：一是整个基因组成大片段的交 叉污染，导致假阳性。这种假阳性可用以下方法解决：（D 操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸 入加样枪内或溅出离心管外。②除薛及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应髙压消毒. 所用离心管及样进枪头等均应一次性使用。③ 必要时，在加标本前，反应管和试剂用紫外线照 射，以破坏存在的核酸.二是空气中的小片段核酸污染，这些小片段比靶序列短，但有一定的同 源性。可互相拼接，与引物互补后，可扩增出PCR产物，而导致假阳性的产生,可用巢式PCR 方法来减轻或消除。

3. 出现非特异性扩増带

PCR扩増后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带与非特 异性扩増带.非特异性条带的出现，其原因：一是引物与靶序列不完全互补、或引物聚合形成二 聚体。二是Mg2+?子浓度过高、退火温度过低，及PCR循环次数过多有关。其次是酶的质和量, 往往一些来源的酶易出现非特异条带而另一来源的醇则不出现.酶量过多有时也会出现非特异性 扩増.其对

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策有：①必要时重新设计引物.②减低酶量或调换另一来源的醇.③降低引物量， 适当增加模板量，减少循环次数.④ 适当提高退火温度或釆用二温度点法（93P变性.65C左 右退火与延伸）. 4.出现片状拖带或涂抹带

PCR扩增有时出现涂抹带或片状带或地毯样带.其原因往往由于酶量过多或酶的质量差， dNTP浓度过高,M矽?浓度过高，退火温度过低'循环次数过多引起.其对策有，（D减少前量， 或调换另一来源的酵：②减少dNTP的浓度：③适当降低浓度.④增加模板量，减少循 环次数。

通常情况下.打开试剂产品（引物，酶等）之前，要注意一下方面： 1. 保存温度 2. 保质期

3. 做适当离心，并做试剂（髙浓度）分装，可防止污染浪费、反复冻融并易稀释成其他 浓度。分装过程注意防止污染（如釆用双蒸水灭菌后分成小管单独保存于冰箱作为 PCR专用水；进行无Naw和RNase处理等等）。 反应体系以20uL-100uL为宜，若选取50叫则可按照顺序依次加入一下物质】

r41uL PCR专用水

Buffer 5uL Pl、P2 各luL dNTP

luL (lOmM)

或

38uL

5uL 各luL 4uL (2.5mM)

O.SuL 0.5uL 』Taq醇

最后加入模板03uLo

注意：1.W对照组，阴性对照必须有.阳性对照可选.

2.可先配多管的体积，混匀再分装，并可多做一管的反应量，减少误差.

PCR参数的设定：

99P 预热 5min 94T 变性 30s 1

55*C退火30s > 25-35个循环 72t 延伸 Imin J 72t延伸 7min

完成后可在PCR仪作15C保存。

最后做琼脂精擬胶电泳，电泳胶的浓度和体积根据实际需要确定.

釆用天根（TIANGEN.天根生化科技有限公司）2XHosStartTaq Master Mix,该

产品包含HotStartTaqDNA聚合酶、dNTPs、Mg%、反应缓冲液、PCR反应増强剂 和优化剂以及稳定剂，浓度为2X。

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