三、项目研究内容
（一）项目研究内容（限600字） 1、栓皮栎愈伤组织的诱导和继代研究 分别以栓皮栎无菌茎段、叶片和叶柄为材料，对愈伤组织诱导培养基的外源生长调节剂种类及配比进行筛选，诱导产生愈伤组织，并筛选适宜的愈伤组织继代培养基和培养条件。 2、栓皮栎愈伤分化及植株再生研究 以栓皮栎愈伤组织为材料，筛选愈伤组织分化出芽的适宜培养基及其外源生长调节剂配比，并进一步开展生根适宜培养基的筛选，建立栓皮栎植株组培再生技术体系。 3、栓皮栎叶肉和愈伤组织原生质体游离研究 以栓皮栎无菌苗叶片和愈伤组织为材料，开展栓皮栎叶肉原生质体和愈伤组织原生质体游离的适宜预处理条件、酶种组合和适宜浓度、等渗剂浓度及酶解时间等相关技术条件研究，建立较为完善的栓皮栎原生质体游离技术体系。 （二）项目研究拟解决的关键问题（限300字） 1、 栓皮栎植株组培再生技术 栎树无性繁殖困难，主要采用种子园技术生产良种，难以同时利用对优良个体的加性和非加性效应，本研究通过建立栓皮栎无菌体系和植株再生系统，解决无性繁殖技术关键问题的同时，为进一步开展体胚发生和基因工程育种研究奠定基础。 2、 栓皮栎叶肉及愈伤组织原生质体游离技术 利用原生质体可以进行细胞融合和体细胞杂交，是一种创造远源杂种，获得同源或异源三倍体、四倍体以及双二倍体的新途径。本研究解决栓皮栎原生质体游离关键技术，建立栓皮栎原生质体游离技术体系，为进一步开展原生质体培养，实现细胞工程育种突破奠定基础。 5
四、项目实施方案
（一）项目研究拟采取的研究方法、技术路线、实验方案（限1000字） 1、研究方案和技术路线 本项目以栓皮栎无菌茎段、叶片、叶柄等为材料，诱导产生愈伤组织，并通过筛选培养基诱导愈伤组织分化为芽和根，构建再生体系；在此基础之上，以无菌苗叶片和愈伤组织为材料，探索原生质体游离条件，形成较为完善的栓皮栎原生质体游离技术体系。 技术路线如下： 栓皮栎茎段外植体 消毒、灭菌、接种 无菌体系 无菌茎段、叶片、叶柄 无菌叶片和愈伤组织 愈伤组织诱导适宜培养基筛选 愈伤组织继代适宜培养基筛选 适宜预适宜酶适宜等适宜酶处理技种及浓渗剂浓解时间术研究 度筛选 度筛选 研究 愈伤组织分化出芽培养基筛选 生根培养基筛选 栓皮栎植株再生体系建立 2、研究方法 （1）栓皮栎外植体的接种和继代培养 栓皮栎原生质体游离技术体系 采集栓皮栎枝条水培，抽条后，切取含腋芽的幼嫩茎段做为外植体，依次经滴露表面消毒5min，自来水冲洗30min，70%酒精浸泡30s，无菌水冲洗3次，0.1%HgCl2浸泡处理2min，无菌水冲洗3次的消毒过程后接入MS(Murashige和skoog，1962）附带6-BA 0.2mg/L的初始培养基。接种后每20至30天转接一次，继代培养基为MS附带6-BA 0.6mg/L，扩大无菌材料数量。
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（2）栓皮栎愈伤组织的诱导 采用正交试验设计，分别以栓皮栎无菌茎段、叶片和叶柄为材料，进行愈伤组织诱导培养基适宜激素种类及配比的筛选，以MS作为基本培养基，筛选因素包括细胞分裂素6-BA和生长素NAA浓度及配比，L9（3）正交试验设计表如下： 表2 愈伤组织诱导培养基激素组合及浓度水平 Element -16-BA (mg·L) Level 1 2 3 （3）栓皮栎愈伤组织分化及植株再生 以栓皮栎愈伤组织为材料，采用L9（3）正交实验设计，以MS为基本培养基对愈伤组织分化为芽的培养激素配比进行筛选，试验设计如下： 表3 愈伤组织分化培养基激素筛选试验设计表 Element Level 1 2 3 6-BA (mg·L) 0 0.5 1.0 -144NAA (mg·L) 0 0.1 0.5 -12，4-D (mg·L) 0 0.5 1.0 -1TDZ (mg·L) 0 0.1 0.5 -10 0.5 1.0 NAA (mg·L) 0 0.5 1.0 -12,4-D (mg·L) 0 0.5 1.0 -1TDZ (mg·L) 0 0.5 1.0 -1将愈伤组织分化形成的芽转移到生根培养基中，以MS培养基为基本培养基对生根培养基激素配比进行筛选，设计如下： 表4 生根培养基激素筛选试验设计表 Element Level 1 2 3 4 6-BA (mg·L) 0 0.1 0.5 1.0 -1NAA (mg·L) 0 0.5 1.0 1.5 -1 （4）栓皮栎叶肉和愈伤组织原生质体的游离 分别以栓皮栎无菌苗叶片和愈伤组织为材料，以正交实验设计结合单因素实验设计，采用酶解法，研究酶的种类与浓度、渗透压稳定剂浓度、酶解时间、预处理方法等因素对原生质体分离效果的影响。将叶片或愈伤组织切成0.5 mm的细条或者碎块，按照1:10的比例置于经抽滤灭菌的含纤维素酶R-10、半纤维素酶、果胶酶Y-23和离析酶R-10的混合酶液中，在一定的温度下、慢速往复式摇床上黑暗酶解。酶液为CPW盐溶液加一定浓度的甘露醇，并附加MES 0.6 g/L、BSA 1 g/L，pH为5.7。酶解产物分别经200目和400目不锈钢滤网依次过滤，以除去未酶解完全的细胞团或组织，500 r/min 离心2.5 min 收集，新鲜洗液洗涤3次，收集原生质体。
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表5 原生质体分离酶种及浓度筛选L9(3)正交实验设计表 Element Cellulase R-10 Hemicellulase Pectinase Y-23 Level 1 2 3 0 1.5% 3% 0 0.25% 0.5% 0 0.25% 0.5% MacerozymeR-10 0 0.5% 1.0% 4 （5）原生质体的产量与活力测定 用血球计数板统计原生质体产量，每个样品计数重复5次，取平均值，最后计算原生质体产量。 原生质体数（个/mL）=5个大格内原生质体总数×5×10000×稀释倍数； 原生质体产量（个/g）=[原生质体数（个/mL）×稀释后体积（mL）]/叶片总质量（g）； 原生质体产量遵从泊松分布，应该对获得的原生质体产量试验数据进行平方根转换后，应用Microsoft Excel软件进行统计分析。 原生质体活力测定用0.01%二乙酸荧光素（FDA）染色。每个样品观测5 次取平均值，统计原生质体活力。 原生质体活力=(发绿色荧光的原生质体数/原生质体总数)×100%。 （6）数据处理 主要采用方差分析对数据处理进行处理，其中涉及百分率的数据在方差处理前进行反正弦平方根转换。
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