分别用水，40%，70%乙醇洗脱，70%部分即为供试品溶液。 3 实验结果
3．1 在本文所建立的色谱方法中，槲皮素和其他杂质成分分离度高，再加上选择性正离子检测的专属性和灵敏度过，使得分析结果的准确度，精密度和检测限得以保证。测得槲皮素对照品(A)，养心菜提取样品(B)的典型色谱见图10。槲皮素的保留时间是3.06min，m/z303.4，相应的柱效理论塔板大于5000。 A 槲皮素标准品的总离子流图(TIC) B:养心菜供试品总离子流图(TIC)
图10 槲皮素标准品和养心菜供试品的总离子流图
3．2 测得槲皮素对照品(A)在保留时间为3。05和供试品(B)保留时间为3。06相对应的质谱图(见图11)。
图9 槲皮素标准品和养心菜供试品对应的质谱图 结论 A B
图11 槲皮素标准品和养心菜供试品对应峰的质谱图 4 结论
标准品(A)中槲皮素和供试品(B)对应峰MS谱图产生6个主要的特征性碎片离子m/z285，273，239，229，211(见图2)，m/z303。4为槲皮素的[M+H]峰。配合离子扫描的数据，验证了样品中含有槲皮素存在。
第三章:养心菜的质量标准研究
养心菜为我省民间使用药物，又名土三七。药用全草，具活血化瘀，止血之功效。临床用于治疗跌打损伤，劳伤，吐血，便血，外伤出血等症。近年来，该植物在我省民间防治心脏病方面广泛应用，被用于降血脂，降血压及其它相关心脏疾病，并被称为\\\救心草\\\或\\\救心菜\\\。为进一步开发利用该药用资源，我们从显微，鉴别，含量测定几个方面对其进行研究，从而确定养心菜的质量标准。 1实验仪器与材料
1.1实验仪器
LEICA旋转石蜡切片机;尼康E200三目显微镜;尼康Coolpix5100数码相机。尼康SUMSING显微描绘器。
岛津SPD-10A VP高效液相色谱仪
SPD-10A VP 紫外检测器，CMB-102色谱工作站(岛津)，微孔滤膜(0。45μm) 1.2 实验材料
槲皮素对照品(中国药品生物制品检定所，批号0081-9904，纯度为99。88%) 养心菜(原植物采自福建连城梅花山栽培品种，移栽本校药圃，标本保存在福建中医学院标本室。干燥药材为带根全草，由福建连城朋口兰花有限公司提供)。
2实验方法与结果 2.1药材性状描述
取养心菜全草药材，对形状，大小，色泽，表面特征，质地，及气味等性状进行描述。
本品为带根茎及根的全草，叶极易脱落而不见。根茎粗短膨大不分枝，直径约
2-3cm，质地轻泡，常纵向开裂，开断面灰白色近木质化，略具粉性，表面灰棕色。根数条细圆锥状，多弯曲，表面灰黄色，断面灰白色至棕黑色。根茎上有六至八条茎，茎细长干瘪皱缩，多纵皱纹，不分枝，直径约0。5-1cm，粗细不一，表面棕有褐色表皮，下部易脱落露出灰黄色内表面，茎节上具有明显叶片脱落后的痕迹。质坚脆，易折断，上半部断面中空。叶多皱缩成线条状，灰绿色至褐绿色，易脱落，展开后，叶片长披针，顶端钝尖，基部楔形，叶上半部边缘具有锯齿。气微味淡，泡水后略带油香气。
2.2显微鉴别
2.2.1组织构造观察:取新鲜全草，对根中部，茎下部木栓化部位及茎中上部未木栓化部位，叶片前端宽阔处中段及楔形基部中段作横切面的徒手切片及石蜡永久切片，采用显微摄影后透视描绘墨线图及用显微描绘器描绘。
2. 2.1.1 根的横切面
木栓层由数列棕黄色细胞组成，木栓细胞切向延长，常有部分脱落。皮层较宽广，约占横切面直径的1/2，由十几列圆形，类圆形或椭圆形细胞组成，壁薄，排列疏松。形成层明显，韧皮部约占直径的1/4，在于木质部的外方排列成环，筛管群成群散在。木质部约占直径的1/4，全部木化，由导管和木薄壁细胞组成。
图1 养心菜根横切面简图(×20)
1木栓层 2侧根迹 3皮层 4韧皮部5 木质部 2.2.1.2根茎横切面
木栓层由数列棕黄色细胞组成，木栓细胞切向延长，常有部分脱落。皮层约占横切面直径的1/3，由十几列圆形，类圆形或椭圆形细胞组成，壁薄，排列疏松。形成层明显成环。韧皮部成环，筛管群散在于形成层外方。木质部束约有10-13个，排列成环，导管群呈T字型排列成U字型或W字型环列，髓位于根茎横切面的最内方，约占横切面直径的1/3，由类圆形或圆形薄壁细胞排列而成，细胞大小不一，排列疏松。
图2养心菜根茎横切面简图(×20) 1木栓层 2皮层 3韧皮部 4形成层 5导管群 6髓 2.2.1.3茎横切面
横切面略成五边形。最外层为一层切向延长的椭圆形表皮细胞，外表面角质化增厚。表皮下2-3层细胞较小，细胞间角质化增厚。皮层宽约占直径的1/2，内皮层明显可见，形成层成环，约成五边形，维管束10至13个成环状排列。中部髓宽广，多为类圆形的薄壁细胞，排列疏松。
图3 养心菜茎横切面简图(×5) 1表皮 2皮层 3内皮层 4韧皮部 5木质部 6髓 7木质部 2.2.1.3叶片横切面观察
上下表皮细胞各一列，细胞呈类圆形或圆形，排列紧密，大小不一，细胞壁角质化增厚，上下表皮均具气孔。叶肉细胞圆形，椭圆形或不规则型，排列疏松，无栅栏组织与海绵组织的分化。主脉仅有一个维管束，维管束外韧型，木质部位于上方;韧皮部位于下方，筛管成群分布形成半月形。叶片中部横切，上表面平坦，下表面主脉处明显向下凸出;叶片基部横切，主脉处的上表面略向下凹陷，下表面明显向下凸出。
图4 养心菜叶横切面简图
A叶片中部横切 B叶片基部横切
1上表皮 2叶肉组织 3维管束 4下表皮 药材粉末及组织解离观察
茎的粉末中导管多为螺纹导管和环纹导管， 直径15。0～45。0微米，根茎和根的粉末中尚可见少量孔纹导管和具缘纹孔导管。木纤维呈淡黄色，两端梭形或渐尖，长85。0～165。0微米，直径25。0～55。0微米，壁厚7。5～10。0微米，有的纤维表面可见人字形或点状纹孔。木栓细胞多角形紧密排列，略成裂瓦状，细胞壁木栓化加厚，大小不一，有的内含有红棕色物质。尚可见角质化加厚的表皮细胞，垂周壁呈波状不均匀加厚。
图5养心菜粉末图(×1000)
1导管 2木栓细胞 3表皮厚壁细胞 4纤维 2.3 养心菜药材粉末中槲皮素的薄层鉴别
2.3.1供试品溶液的制备:取养心菜药材粉末0。2g，放置具塞三角瓶中，加甲醇5ml，密塞，振摇10min，放置10min后过滤，得到样品液。
2.3.2对照品溶液的制备:取槲皮素对照品适量，加甲醇使成1ml含1mg的对照品溶液。
2.3.3薄层层析:将上述两种溶液分别点于同一硅胶G板上，以甲苯:乙酸乙酯:甲酸(8:2:1)为展开剂[15]，展距11cm，取出晾干，喷以三氯化铝溶液，于105 C烘10min后置紫外灯365nm处检视，供试品溶液在对照品槲皮素相应的位置有显相同颜色的荧光斑点(有干扰色)，见图6。
图6 甲醇提取液的薄层色谱图 图7 柱层析后的薄层色谱图
注:1药材样品液 3槲皮素对照品液 注:2药材样品液 3槲皮素对照品液 2.3.4硅胶柱分离后的薄层鉴别 精密秤取养心菜药材粉末3g，，分别置于索氏提取器中，加100ml乙醚回流至无色，弃去乙醚液，药渣挥干乙醚，再加70%乙醇100ml，加热回流至无色，提取液浓缩至干，加70%的乙醇溶解，定量转移至50ml的容量瓶，70%乙醇定容，得到粗提液;精密移取10ml至蒸发皿中，挥干乙醇，加水溶解，定量转移至分液漏斗，加正丁醇20ml，15ml，15ml依次萃取三次，合并萃取液，挥干正丁醇，加少量甲醇溶解，用1g硅胶吸附，烘干后得到样品粉末。湿法上柱，先以甲苯50ml洗脱，再以甲苯:乙酸乙酯(8:2)50ml洗脱，洗脱液均弃掉，最后以甲苯:乙酸乙酯:甲酸(体积比为8:2:1)洗脱，先弃去20ml，再收集15ml洗脱液，得样品液，将样品液和对照品溶液分别点于同一硅胶G板上，以甲苯:乙酸乙酯:甲酸(体积比为8:2:1)为展开剂[15]，展距11cm，取出晾干，喷以三氯化铝溶液，于105 C烘10min后置紫外灯365nm处检视，供试品溶液在对照品槲皮素相应的位置有显相同颜色的荧光斑点(有干扰色)，见图7。
2.3 含量测定 2.3.1实验条件 2.3.1.1色谱条件
色谱柱:SHIM-PACK VP C18(250mm×4。6mm，10μm) 流动相:甲醇-0。4%磷酸(55:45); 流速:1。0mL●min-1; 检测波长:370nm; 进样量:20μL。
2.3.1.2用二极管矩阵检测器分析了槲皮素对照品峰及养心菜中所测成分相应色
谱峰的紫外光谱，结果紫外光谱基本一致，均在370nm处有一最大吸收。 2.3.2 对照品溶液的配制
精密称取对照品3。04mg，置50ml容量瓶中，加入甲醇使溶解并稀释至刻度，摇匀，精密移取6mL至50mL量瓶中，用甲醇定容至刻度，摇匀，即得含槲皮素7。296μg●mL-1的对照品溶液。
2.3.3 供试品溶液的配制
精密称取养心菜药材粉末1g，置索氏提取器中，加100mL甲醇加热回流至无色，回收甲醇至40mL，将提取液转移至50mL量瓶中，定容，摇匀。精密吸取20mL，加入10mL20%的盐酸溶液，10mL甲醇水解1h，冷却，转移至50mL量瓶中，并稀释至刻度，摇匀，用微孔滤膜过滤(0。45μm)，即得。
2.3.4 养心菜药材水解时间的确定
养心菜生药材经干燥粉碎后，精密称取2g，置索氏提取器中，加150mL甲醇加热回流至无色，回收甲醇至约90mL，将提取液转移至100mL量瓶中，定容，摇匀，作为总样储备液。从总样储备液中精密吸取20mL样品液，共3份，加入10mL20%的盐酸溶液，10mL甲醇分别水解，A:0。5h;B1。0h;C1。5h。冷却，将水解液转移至50mL量瓶中，定容，摇匀，经0。45μm微孔滤膜过滤，分别取续滤液作为供试品溶液A，B，C。取上述供试品溶液均进样20μL，按上述色谱条件测定峰面积，结果槲皮素的量分别为A:0。275mg/g;B:0。377 mg/g;C:0。378 mg/g。随水解时间的增长，水解1h与1。5h槲皮素的量基本相同，因此，确定水解时间为1h。
2.3.5 标准曲线的制备
精密称取槲皮素对照品3.04mg，置于50mL量瓶中，加入甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，精密吸取上述对照品溶液1.0，2.0，4.0，6.0，10mL至50mL量瓶中，用甲醇定容至刻度，摇匀，按\\\项下色谱条件进样，以对照品浓度为横坐标，峰面积积分值为纵坐标，绘制标准曲线，回归方程为Y=40386X-14138，r =0。9991， 槲皮素在1.216～12.16μg·mL-1范围内呈良好的线性关系。
2.3.6 系统适应性实验
按\\\项下的色谱条件下分别进样20μL对照品溶液和供试品溶液，槲皮素的保留时间为15.8min左右，理论塔板数为7645.4，主成分和相邻杂质峰得到良好的分离，分离度大于5，结果令人满意。对照品和供试品的色谱图见图8。
A B
图8 槲皮素对照品和样品的色谱图
A-槲皮素对照品；B-养心菜药材；1-槲皮素 Fig1 HPLC chromatogram of reference and sample A-reference；B- Sedum aizoon L。；1-quercetin 2.3.7 精密度实验
取上述槲皮素对照品溶液20μL，注入液相色谱仪，连续进样5次，依法测定，五次的结果为1。237μg·mL-1，1。227μg·mL-1，1。223μg·mL-1，1。195μg·mL-1，1。192μg·mL-1。RSD=1。66%。
2.3.8 稳定性实验
将同一药材供试品溶液在室温下考察10h，每间隔一定时间进样，共测定5次，结果为0。379 mg●g-1，0。374 mg●g-1，0。369 mg●g-1，0。362 mg●g-1，0。377 mg●g-1，RSD为1。16%，表明供试品溶液在24h内稳定。
2.3.9 重现性实验