电转化感受态细胞的制备

1. 用枪头挑取单克隆菌落，投入盛有10ml LB液体培养基的50ml离心管中。（同时做培

养基和枪头的空白对照）

2. 37℃，220rpm，培养14-16个小时。

3. 第二天，以1：100的比例将这10ml菌液倒入1000ml LB液体培养基中，37度，220rpm，振摇2-3小时，每半小时测一次OD，当OD值达到0.3-0.4时，停止培养。

4. 将菌液在冰上预冷30分钟，随后将菌液分装到500ml 预冷的离心杯中，4℃，2500rpm离心10分钟。

5. 弃上清，离心杯中加入少量ddH2O，使沉淀悬浮后，再将水注满离心杯，4℃，4000rpm离心10分钟。

6. 弃上清，加少量灭菌水，重悬菌体，再将水注满离心杯，4000rpm，4℃，离心10min。

7. 弃上清，往离心杯中加入少量10%甘油(灭菌，预冷)，重悬菌体，再加满10%甘油, 4℃, 4000rpm, 离心10min。

8. 弃上清，每个离心杯中加入5ml10％的甘油，使沉淀悬浮后，将菌液以300ul/管分装于1.5ml的离心管中，-80 ℃冰箱中保存。同时取100 μl感受态加0.01ng puc18直接电穿孔转化，检测转化效率。

9. 次日观察转化子生长情况，并记录。

2．连接产物纯化

1．将连接产物转移至一1.5ml Eppendorf管中，加入下列试剂:

10ul of ddH2O

2ul of 3M NaAC（PH5.2）

50ul of 无水乙醇

轻轻混匀，稍微离心并将其置于-20℃放置1小时以上；

2.4℃，top Speed 离心30分钟；

3.小心移去上清，避免接触到管底的沉淀物；

4.加入500ul70％的乙醇，轻轻颠倒几次洗涤沉淀（注：不要离心混匀）；

5.4℃，top Speed离心5分钟；

6.小心移去上清，将此Eppendorf管置空气中直至无乙醇气味；

7.加入10ulddH2O重新溶解沉淀，4℃短期保存，-20℃长期保存备用；

3.电转化

1. 从-80℃冰箱中取出感受态细胞，置于冰上解冻；

2. 取1 μl 纯化后的质粒于一1.5ml的离心管中，将其和0.1CM的电极杯一起置于冰上预冷。

3. 将40～100ul解冻的感受态细胞转移至此1.5ml 的离心管中，小心混匀，冰上放置10min。

4. 打开电转仪，调至Manual，调节电压为2.1KV。

5. 将此混合物转移至已预冷的电极杯中，轻轻敲击电极杯使混合物均匀进入电极杯的底部；

6. 将电极杯推入电转化仪，按一下pulse键，听到蜂鸣声后，向电击杯中迅速加入1000μl的SOC液体培养基，重悬细胞后，转移到1.5ml的离心管中。

7．37℃，220－250rpm复苏1小时。

8. 取20ul转化产物加160ulSOC涂板，放于37℃温室，过夜培养，次日查看转化结果。其余菌液加1：1的30％的甘油后混匀－80℃保存。

注：每块加有Amp的平板上均匀涂有X-Gal 80μl ，SOC 80μl，IPTG 20 μl。

4.电击杯清洗流程

1． 用清水将电击杯稍冲一下。

2． 向电击杯中加入的75%酒精浸泡2hr。

3． 弃去酒精，再用蒸馏水冲洗2~3遍，然后用1ml的枪吸取超纯水反复吹打电击杯10遍以上。

4． 加入无水乙醇2ml于电击杯中，浸泡30分钟。

5． 弃去无水乙醇，于通风厨内挥干乙醇。

6． 将清洗好的电击杯放入-20 ℃冰箱内待用。

注：1．不同样品使用的电机杯应分开；

2．每周用1％酒精浸泡30分钟。

电转化注意事项

一、 制备感受态的菌液收集时间： 1、准确测定OD值：OD在1.2～1.5之间。

1） 为了准确测定OD值，建议将菌液稀释不同浓度测定（1、2、4、8、16倍稀释，看其OD值是否呈线性关系）。每个倍数做3－5个重复，应该可以大致推断OD值是否准确！菌液看上去浑浊，但OD值不高，很可能OD稀释倍数不够！

2） OD值是否测准也可以这样估算：OD600为40左右时，菌体湿重（6000rpm离心5min）约0.95g/10ml。高密度发酵时菌体湿重将相应下降。

2、75ml的菌，经18h左右的培养，最后sorbital洗涤完毕后，50ml离心管里所剩菌体特别浓，需要1ml sorbitol才可溶解为糊状。正常培养的OD在1.2～1.5之间的500ml菌液，收集的感受态也用1ml稀释的，没那么粘稠。可以看看降低培养温度（27摄氏度）或缩短培养时间（12h）。

3、甚至不用转接,直接挑单克隆在50－100mlYPD中摇过夜，效果也很好

二、制备感受态的菌液量

如果只转一个样品，50ml就够了，一般50ml的培养液如果OD值正常的话够做10管感受态的，其他的按比例缩小。用大试管摇5ml菌液，然后取1ml毫升在1.5mlEP管中制感受态，每一步的离心时间30秒就行。整个流程时间短，制备好的感受态用来做转化的效率很高。 山梨醇离心，洗涤的过程之后的重悬的时候注意浓度，不要过于粘稠和稀释。

三、感受态的保存

感受态细胞做好后由于电转化杯还没有处理好等原因，在冰上放几个小时再做可能有一定的影响，尽量马上制备马上转化。如果感受态细胞要保存，不需要加甘油，一般80ul EP管分装，-70 或 -80 摄氏度保存。

另附：酵母GS115点种分离纯化

接种GS115于5ml YPD液体培养基，30℃，200rpm振荡过夜，涂布 YPD平板，30℃培养48 小时，用 YNB基本培养基和含His的补充培养基作点种分离纯化，挑选在补充培养基生上生长而在基本培养基上不生长的单菌落划YPD平板，4℃保存。

四、电转化注意点：

1、感受态做好后，最后一次吸出sorbital时，不是直接倒调的，而是用毛细管轻吸出来的，这样可能使剩下的感受态纯净些。

2、最后用毛细管取出100ul出来，加入质粒，混匀！（怕量不够，吸得很多，电转时效果反而不好。 ）

3、电转杯清洁处理:一般先冲洗，洗净；然后浸泡在75%的乙醇中；使用前我们都是放在超净台上，开启紫外，边吹风晾干，边进行紫外照射。电转杯的新包装或重复使用可能对转化率有一定的影响。

4、电击的时候，电压数以及电击时间可以摸索一下，适当增加电压或者延长电击时间都可以。电击条件比如1.5kv，放电4.8～5.5ms。电击所有过程都要尽量在冰上进行，电击时间可以减少一点，设置为5ms左右，电击之后马上加入预冷的山梨醇溶液，转移至EP管，30度静止培养1h。如果菌体悬液浓度比较大的时候，在制备感受态的时候要留心一下操作中的问题了。

5、电击之后，加入1ml的山梨醇，吸入1.5ml的ep管中，置于30度摇床低速培养1h，再涂板。

6、注意的是处理液中的DTT是在使用前加入，其它配好后于4度保存，DTT单独于-20度保存，可配成100倍的贮备液。

7、转化后1ml用sorbitol重悬的细胞悬液不能全部涂在一块板子上，按标准程序制作的感受态一般3块左右可能比较合适，以干燥后看见一薄层淡淡的白色为宜。转化子会在白色的薄层上长出圆韵、饱满的大菌落的。

五、转化试剂和培养基的正确准备方法

1、MD板子提前几天做好，放在冰箱里，涂板的时候吸收效果会好些。如果是新板子，可能吸收不是太好，板子上有些积层，反而不利于生长。

2、YNB42度水浴一会，然后过滤除菌，YNB是加到培养基里面的，去离子水pH偏低，建议直接用蒸馏水就可以（关系不是太大）。

3、山梨醇，以及无菌去离子水均是冰冻，存放在4度冰箱中

4、一般用10ug以上质粒用SalI酶切，然后直接加乙醇沉淀，70％乙醇洗一遍，约20ul ddH2O重溶。转化效率一般大于100个克隆每ugDNA。有人用LiCl和DTT处理细胞，转化效率很高，可以试试。建议你不要用胶回收kit，回收的DNA可能还有盐，导致电击时放电时间很短。