实验四、多酚氧化酶的活性的测定及酶学性质 下载本文

实验四、马铃薯块茎多酚氧化酶(PPO)活性测定及酶学性

一、 实验目的

1掌握分光光度法测定多酚氧化酶活性的一般原理及操作技术方法。 2了解酶的活性与植物组织褐变以及生理活动之间的关系。 二、 实验原理

马铃薯不耐储藏,在加工过程中去皮切分后非常容易发生酶促褐变,使外观品质和营养价值大为降低,制约着马铃薯的开发利用。酶促褐变是马铃薯加工产业必须解决的难题。其中多酚氧化酶是导致马铃薯等果蔬发生酶促褐变的重要酶类。多酚氧化酶活性大小直接影响酶促褐变程度。

多酚氧化酶(polyphenol oxidase,PPO)又称酪氨酸酶、儿茶酚酶、酚酶等.是自然界中分布极广的一种含铜氧化酶.普遍存在于植物、真菌、昆虫的质体中。植物受到机械损伤和病菌侵染后,PPO催化酚与O2氧化形成醌,使组织形成褐变.以便损伤恢复,防止或减少感染,提高抗病能力。研究多酚氧化酶的特性对食品的加工与保藏工艺有非常重要的意义。因此,检测食品中多酚氧化酶具有重要意义。

多酚氧化酶是一种含铜的氧化酶,在一定的温度、pH条件下,有氧存在时,能使催化邻苯二酚氧化生成有色物质,单位时间内有色物质在410nm处的吸光度与酶活性强弱成正相关,在分光光度计410nm处使反应体系的OD值产生变化,通过OD值的变化确定PPO的酶活大小。

多酚氧化酶

邻苯二酚(儿茶酚)+1∕2 O2 ——————→ 邻醌 + H2O

三、 试验材料、试剂及试验用品 1.材料:马铃薯块茎。

2.仪器:分光光度计;离心机;恒温水浴;研钵;试管;移液管;容量瓶 3.试剂:0.1mmol/L 磷酸缓冲液(pH=7.0);0.01mol/L邻苯二酚;0.1mol/L磷酸氢二钠;0.1mol/L磷酸二氢钠;10mmol/L柠檬酸;10mmol/L抗坏血酸;10mmol/L乙二胺四乙酸二钠(EDTA);10mmol/L亚硫酸钠

四、 实验方法:

1.多酚氧化酶的提取

取0.5g马铃薯块茎样品,加入预冷的磷酸缓冲液(pH7.0)3ml,研磨匀浆,转移到离心管中,再用7mL磷酸缓冲液冲洗研钵,合并提取液,在4℃下离心(8000r/min)5min,取上清液为多酚氧化酶提取液,并量取粗酶液体积。 2.多酚氧化酶活性测定

采用比色法测定。将0.5ml邻苯二酚加入2ml磷酸缓冲液(pH7.0)中,加入0.5ml酶提取液,立即于波长410nm下测定吸光值,2min后再计吸光值,以不加酶提取液的反应液做对照(注意空白为:2.5 ml缓冲液和0.5 mL邻苯二酚溶液)。以每分钟吸光度变化0.01为1个多酚氧化酶活性单位。

表1 多酚氧化酶活性测定 磷酸缓冲邻苯二粗酶液OD410 2min后△OD410 酶活力液(mL) 酚(mL) (mL) OD410 (U) 空白组 2.5 0.5 0 试验组 2.0 0.5 0.5 3.多酚氧化酶酶活的计算公式:

以每克样每分钟内A410增加0.01为1个酶活力单位U。

△A410×酶提取液总量(ml) 酶活力(0.01A/g min)= ————————————————— — —

0.01×反应时间(min)×样品鲜重(g)×测定时酶液用量(ml)

4 酶学特性

4.1 PH对多酚氧化酶活性的影响

室温下在试管中加入已配好的不同pH值的缓冲溶液2.0mL,邻苯二酚0.5ml,多酚氧化酶粗酶液0.5 mL,混匀后迅速测定吸光度,转换为多酚氧化酶的活性。以缓冲液pH值为横坐标,多酚氧化酶活性为纵坐标,作出酶活—pH曲线,以确定最适pH值。

表2 pH对多酚氧化酶活性的影响 组不同pH的磷酸邻苯二粗酶液OD410 2min后△OD410 酶活力号 缓冲液(mL) 酚(mL) (mL) OD410 (U) 1 pH=4,2.0mL 0.5 0.5 2 pH=5,2.0mL 0.5 0.5 3 pH=6,2.0mL 0.5 0.5 4 pH=7,2.0mL 0.5 0.5 5 pH=8,2.0mL 0.5 0.5 4.2 温度对多酚氧化酶活性的影响

试管中加入pH 7.0的磷酸盐缓冲溶液2.0mL, 以邻苯二酚溶液0.5mL为底物,在不同温度(常温、40、60℃的温度条件)下保温5min后,加入多酚氧化酶粗酶液0.5mL,混匀后在室温下测定多酚氧化酶的活性。以温度为横坐标,多酚氧化酶活性为纵坐标,作出酶活—温度曲线,以确定最适温度。

表3 温度对多酚氧化酶活性的影响 温度 磷酸缓冲液邻苯二粗酶液OD410 2min后△OD410 酶活力(mL) 酚(mL) (mL) OD410 (U) 室温 2.0 0.5 0.5 40℃ 2.0 0.5 0.5 60℃ 2.0 0.5 0.5 4.3 抑制剂对多酚氧化酶活性的影响 将抑制剂抗坏血酸(VC)、柠檬酸、亚硫酸钠、EDTA分别用pH7.0的磷酸盐缓冲溶液配制成10mmol/L的溶液,在室温下分别取上述抑制剂 2.0mL,以邻苯二酚溶液0.5mL为底物,加入多酚氧化酶粗酶液0.5mL,混匀后在室温下测定多酚氧化酶的活性。以抑制类型为横坐标,多酚氧化酶活性为纵坐标,绘制抑制剂对酶活影响的图形,分析抑制剂对酶活性影响。

表4抑制剂对多酚氧化酶活性的影响 抑制剂 磷酸缓冲邻苯二粗酶液OD410 2min后△OD410 酶活力液(mL) 酚(mL) (mL) OD410 (U) 抗坏血酸 2.0 0.5 0.5 柠檬酸 2.0 0.5 0.5 亚硫酸钠 2.0 0.5 0.5 EDTA 2.0 0.5 0.5 五、注意事项

1、反应混合液必须现配现用,否则会因邻苯二酚自动氧化而失效; 2、在试验中加入一种酚结合剂--聚乙烯吡咯烷酮(PVPP),它能与酚类化合物强烈地发生缔合作用,从而消去酶反应体系中的底物,使 PPO活性的测定更接近其真值。

3、使用分光光度计时要求动作快速、熟练。

4、加样时,先加缓冲溶液,再加底物邻苯二酚,摇匀,在测量之前最后加酶提取液。 六、思考题

1. 本试验中使用到磷酸缓冲液,请问磷酸缓冲液在本试验中的作用? 2. 试分析不同温度、pH对马铃薯多酚氧化酶的影响? 3. 谈谈你对多酚氧化酶活性性质的认识。 参考文献:

曹建康,姜微波,赵玉梅编著.果蔬采后生理生化实验指导.中国轻工业出版社,2007.9.

毛丽梅,邓红,马安德,卢晓翠 。食品安全综合实习指导.科学出版社,2013.02. 104-105

李彩霞 张芬琴 张喜峰 赵金梅 白生文