T-DNA上共含有tms、tmr和tmt 3 套基因。其中tms和tmr 2基因分别控制合成植物生长素与分裂素，促使植物创伤组织无限制地生长与分裂，形成冠瘿瘤。tms基因控制由色氨酸产生生长素吲哚乙酸的生物合成途径。

在T-DNA 的两端还含有左右2 个边界，左边界(left border, LB)和右边界(right border, RB)是长为25bp的末端重复顺序，在切除及整合过程具有重要意义。 9

根癌农杆根瘤菌感染植物根部是因植物根部损伤部位分泌酚类物质乙酰丁香酮和羟基乙酰丁香酮，这些物质诱导Ti质粒上的vir基因及根癌农杆菌染色体上一个操纵子表达。vir 基因产物将Ti质粒上的T-DNA单链切下,根癌农杆菌染色体上的操纵子表达产物则与单链T-DNA结合形成复合物，转化植物根部细胞。

Ti 质粒的转化机理

整个过程大致可分为以下几个步骤：

①根癌农杆菌对植物细胞的识别和附着； ②根癌农杆菌对植物信号物质的感受；

③根癌农杆菌Ti 质粒上的vir 基因以及染色体上操纵子的活化； ④T-DNA 复合体的产生； ⑤T-DNA复合体的转运；

⑥T-DNA整合到植物基因组中。 野生型Ti 质粒的改造

Ti质粒属天然载体，但野生型Ti质粒不能直接用作克隆外源基因的载体。 原因：

①野生型Ti质粒分子过大；

②野生型Ti质粒具有多个酶切位点；

③T-DNA上的tms和tmr基因产物干扰受体植物内源激素的平衡；

④冠瘿碱合成过程消耗大量精氨酸和谷氨酸，直接影响转基因植物细胞的生长代谢； ⑤野生型Ti质粒无大肠杆菌(E·coli)的复制起点和作为转化载体的选择标记基因。 12

对野生型Ti质粒改造包括以下方面：

①删除T-DNA上的tms、tmr和tmt基因；

②加入大肠杆菌复制起点和选择标记基因，构建根癌农杆根瘤菌-大肠杆菌穿梭质粒； ③引入植物细胞的筛选标记基因，如细菌来源的新霉素磷酸转移酶II基因(NPTII)等，便于转基因植物细胞的筛选；

④引入植物基因启动子和polyA化信号序列； ⑤插入人工多克隆位点，以利外源基因克隆；

⑥除去Ti质粒上的其它非必需序列，最大限度地缩短载体的长度。 13

植物表达载体的构建

中间表达载体不能将外源基因转化进植物细胞。因此，必须将中间表达载体引入到上述已改造的受体Ti 质粒中，并构建成能侵染植物细胞的基因转化载体(它是由两种以上质粒构成的复合型载体，故称之为载体系统)，才能在植物基因转化中应用。 利用根癌农杆菌的Ti质粒，发展了一元载体系统和二元载体系统。 14

一元载体系统就是指含有目的基因的中间表达载体与改造后的受体Ti质粒通过同源重组所

产生的一种复合型载体，通常又称为共整合载体(co-integrated vector)；

二元载体(binary vector)系统是指由两个分别含T-DNA和Vir区的相容性突变Ti质粒构成的系统。其中一个是缺失或部分缺失T-DNA序列。它的主要作用是表达毒蛋白，激活T-DNA 的转移，故称为辅助Ti质粒(helper Ti plasmid)；另一个则是含有T-DNA的质粒。 15

Ti 质粒介导的转移转化方法

根癌农杆菌Ti质粒介导的植物基因转化方法，其基本程序包括：含重组Ti质粒的根癌农杆菌的培养，选择合适的外植体，根癌农杆菌与外植体共培养，外植体脱毒及筛选培养，转化植株再生等步骤。 叶盘转化法；

原生质体共培养转化法； 整株感染法； 16

叶盘转化法(leaf dish transformation) 操作步骤为：

用打孔器从消毒叶片上取下直径为2～5mm 圆形叶片，即叶盘。将叶盘放入培养至对数生长期的根癌农杆菌液浸泡几秒钟，使根癌农杆菌浸染叶盘。然后用滤纸吸干叶盘上多余的菌液，将叶盘置于培养基上共培养2～3d，再转移到含有头孢霉素或羧苄青霉素抑菌剂的培养基中，除去根癌农杆菌。同时加入抗生素进行转化体的筛选，使转化细胞再生为植株。 17

原生质体共培养转化法

是以原生质体作为受体细胞，通过将根癌农杆菌与原生质体作短暂的共培养，然后洗涤除去残留的根癌农杆菌后，置于含抗生素的选择培养基上筛选出转化细胞，进而再生成植株。 转化体不含嵌合体，一次可以处理多个细胞，得到相对较多的转化体。 18

整株感染法

模仿根癌农杆菌天然的感染过程，用根癌农杆菌直接感染植物而进行遗传转化的一种简单易行的方法。 做法

人为地在植株上造成创伤，然后把含有重组质粒的根癌农杆菌接种在创伤面上，或把含有重组质粒的根癌农杆菌注射到植物体内。使根癌农杆菌在植物体内进行浸染实现转化。 19

发根农杆菌介导法

发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)是与根癌农杆菌同属的一种病原土壤杆菌。但与其不同的是，发根农杆菌从植物伤口入侵后，不能诱发植物产生冠瘿瘤，而是诱发植物产生许多不定根。

发状根的形成是由存在于发根农杆菌中的Ri质粒(root inducing plasmid,根诱导质粒)所决定的。 20

Ri质粒是发根农杆菌染色体外的遗传物质。属于巨大质粒，其大小为200～800kb。Ri质粒和Ti质粒不仅结构、特点相似，而且具有相同的寄主范围和相似的转化机理。 Ri质粒的T-DNA也存在冠瘿碱合成基因，且这些合成基因只能在被侵染的真核细胞中表达。

野生型Ri质粒可以直接作转化载体。

与Ti质粒相同，Ri质粒基因转化载体的构建也主要采用有共整合载体和双元载体系统。由Ri质粒诱发产生的不定根组织，经离体培养后，一般都可再生完整的植株。 21

二、基因改良植物

改良植物指的是：通过人工处理（如杂交、基因克隆-导入、诱变等方法）的方法，对天然植物进行改造，具有更好的利用价值的植物。基因改良植物是改良植物类型中的一种，是利用转基因技术实现植物品种的改良。主要包括：抗害虫，抗除草剂，抗病毒，控制果实成熟，改变花型花色，抗环境压力，生产高品质作物等。 22

目前随着转基因技术的发展基因改良植物已越来越多，其优越性也为更多人所了解。开发基因改良植物已成为了植物改良发展的趋势之一。 23

基因改良植物种类：抗虫害植物、抗病毒转基因植物、抗逆转基因植物、利用转基因改良植物品质 24

抗虫害转基因植物

抗虫害转基因植物很多。包括水稻，棉，玉米，马铃薯，番茄，大豆，蚕豆，烟草，苹果，核桃，杨，菊花和白花三叶草等。益处就是防治作物虫害。 25 抗虫棉

抗虫棉目前分为转基因单价抗虫棉和转基因双价抗虫棉。 转基因单价抗虫棉是将一种细菌来源的、可专门破坏棉铃虫消化道的Bt杀虫蛋白基因经过改造，转到了棉花中，使棉花细胞中存在这种杀虫蛋白质，专门破坏棉铃虫等鳞翅目害虫的消化系统，导致其死亡，而对人畜无害的一种抗虫棉花。

转基因双价抗虫棉是我国科学家将杀虫机理不同的两种抗虫基因(Bt杀虫基因和修饰的豇豆胰蛋白酶抑制剂基因)同时导入棉花，研制成功的一种抗虫棉花。由于这两种杀虫蛋白功能互补且协同增效，使双价抗虫棉不但可以有效延缓棉铃虫对单价抗虫棉产生抗性，还可增强抗虫性。预计将对控制棉铃虫对抗虫棉的抗性发展起到关键作用。 28

抗病毒转基因植物

抗病毒转基因植物主要有烟草花叶病毒的转基因烟草，抗病毒的转基因小麦、甜椒、番茄等多种作物。

抗CMV病毒转基因番茄 抗CMV病毒转基因甜椒 转查尔酮合酶矮牵牛花 30

利用病毒基因开发抗病毒植物

外壳蛋白基因：该策略主要是将病毒的衣壳蛋白（CP）基因进行体外克隆，体外重组及构建表达盒，然后将重组的CP基因转化到植物细胞内，使CP基因在植物体内得以表达，从而使转基因植物获得抗病毒或相关病毒侵染的能力。 移动蛋白基因：植物病毒系统侵染寄主经过2个明显的过程：病毒通过胞间连丝在细胞间的移动和通过维管束系统在器官间的转移。病毒在细胞间的移动，主要受病毒本身编码的移动蛋白（movement protion，MP）和寄主因素所控制。MP一方面能够修饰胞间连丝，而增加

其有效孔径；另一方面能结合病毒核酸，使病毒核酸的三维结构改变成丝状的核酸—蛋白质复合体，这一复合体使病毒较容易地通过胞间连丝。 31

利用植物自身的抗病毒基因

上述抗病毒方法都源于病毒基因组，与此同时，植物在其长期的进化过程中也逐渐获得了一系列复杂的防御机制来保护自己，如过敏性反应、免疫性等。长期以来，人们一直在寻找这种植物自身的抗病毒基因，并取得了一定的进展。 32

植物受病毒或其它病原体感染时产生的过敏反应所诱发的防御反应主要是以植物编码的病程相关蛋白（Patho genesis-related protein，PR）为物质基础的，至少包括以下3个方面：直接对病原体进行攻击（如诱导产生的水解酶类）；宿主代谢调整以适应过激条件（如过氧化物歧化酶）；将病原体局限于侵染的位点（如木质化酶等酶类）。如果将这些基因分离出来用于抗病毒基因工程，则可能提高工程植株本身内在的抗性，也有人认为抗性并不是靠PR的单独作用，而是它们共同作用的结果。虽然目前转PR基因植物的抗性水平并不理想，但随着植物防御机制的深入研究，这种抗病毒手段应该具有很好的应用前景。 33

潜在自杀基因制备策略：将植物来源的毒素蛋白（如抗病毒蛋白等）基因克隆到某种病毒的启动子下游，再将这一重组体以反义形式克隆到植物表达载体中并转化植物。植物体内转录出包含病毒启动子与该病毒蛋白在内的复合物，但不会翻译表达有功能的活性毒素蛋白。然而，一旦该种病毒侵染植物，其体内已经转录出的反义RNA会利用病毒酶系统转录出正义链的mRNA，mRNA再翻译表达则产生有功能的活性毒素蛋白，结果病毒侵染了的细胞死亡而邻近的细胞不受影响。 34

抗TMV的N基因：在植物诱导抗性中过敏性坏死斑反应是一些植物对某些病毒侵染的一种强烈的抗病反应，它被认为是抗病的标志，如将烟草花叶病毒（TMV）接种到心叶烟上，则在接种的叶片上产生坏死斑反应，过敏性坏死斑形成是由于植物内含有一控制坏死斑反应的基因，即N基因的存在造成的，因大多数过敏性坏死斑反应是由单个基因控制的，易被克隆利用，例如人们已成功地将N基因克隆，转入番茄植株，获得的转基因番茄对TMV表现为强烈的过敏性反应。 35

抗逆转基因植物

不良环境 (如低温、高温、干旱、盐渍等 )作用于植物，将会引起植物体内发生一系列的生理代谢反应，表现为代谢和生长的可逆性抑制，严重时甚至引起不可逆伤害，导至整个植株死亡。

通过转基因能消除或减轻这种可逆抑制，从而使得植物能在严酷环境下生长。如抗盐碱和抗干旱的烟草，耐寒烟草、番茄，抗除草剂大豆、玉米等。好处是降低了环境条件对农作物的生产的影响。 37

利用转基因改良植物品质

转基因延熟番茄，富含赖氨酸的转基因玉米，花色变异的转基因牵牛花。 38

生物制药技术

生物技术制药是指运用微生物学、生物学、医学、生物化学等的研究成果，从生物体、生物组织、细胞、体液等进行药物制造的技术。