示细胞壁没有完全去除。 5、原生质体活力检测

目测法：在显微镜下观察，根据细胞形态、流动性确定原生质体活力。

FDA 法：FDA（二乙酸荧光素）是一种非极性物质，能自由地穿越细胞质膜，在活细胞内，FDA 被酯酶裂解即发荧光（荧光素），由于荧光素不能自由通过质膜，因而可以在荧光显微镜下通过具荧光的细胞的观察确定细胞活性。

伊凡蓝法：伊凡蓝不能穿过质膜，只有质膜受到严重损坏使，细胞才能被染色，因而可以通过细胞被染色与否确定活性。

酚藏花红染料法：死细胞着为红色。 6、影响原生质体活力的因素 分离材料的生理状态

酶解条件：酶质量、浓度、酶解温度、酶解时间、酶溶液的渗透压 分离条件：离心次数、离心速度、纯化方法、分离持续时间 环境条件：操作环境的温度、分离用具的影响 四、原生质体培养 （一）培养基 1．渗透压

常用的渗透压调节剂：甘露醇、山梨醇、蔗糖和葡萄糖等。 原生质体的渗透压原则：培养基渗透压与细胞渗透压等渗。 2．无机盐

. 大量元素浓度；

. NO3 －和NH4+的比例； . Ca2+浓度 3．有机成分

维生素、氨基酸、糖及糖醇等，酵母提取物、水解酪蛋白。 4．激素

常用的激素：NAA、IAA、BA 与2,4-D 5．pH 值

（二） 原生质体培养方法 液体浅层培养 固体培养

液体－固体双层培养 琼脂糖珠培养

（三）愈伤组织形成和植株再生 细胞壁再生

细胞分裂成细胞团 愈伤组织形成

愈伤组织分化成芽和根 完整植株再生 12

五、影响原生质体培养的主要因素 (一)基因型

较早的试验曾证明矮牵牛叶肉原生质体的不同生长发育时期是受不同基因所控制的。 (二)原生质体的来源

供体材料体类型 供体细胞的分化程度 供体细胞的生长同步性

(三)起始培养密度与培养基 基本起始密度 培养基激素水平

密度与培养基营养成分完全性

(四)原生质体培养中的一些生理问题 1．逆境反应

细胞壁降解酶是一种逆境诱导剂，因此可以产生活化氧引起脂类过氧化，减少细胞流度同时伴随着细胞膜的渗漏(Ishii H.,1988)。 2．修复机理

原生质体分离时会丢失一些不同的细胞结构。使原生质体中细胞骨架的组分、结构、方向发生变化，最常见的是引起细胞极性的改变(Simmond D H., 1991)，同时也会干扰质膜的蛋白质系统。

原生质体修复其质膜及其中的蛋白质组分的能力，细胞壁再生的能力及细胞骨架的修复修复和调整能力都对它们能否进一步发育有很大影响。 3．细胞脱分化与细胞分裂

分离的原生质体原来的细胞状态常常会影响脱分化的进行。

细胞在培养初期的一些变化，如液泡消失、细胞体积增加、细胞质变浓，核蛋白体增加等，与此同时DNA 开始复制，随后染色质变浓，原生质体脱分化成为类似分生组织状态的细胞。 原生质体培养初期的细胞分裂至少涉及到以下多个因子：细胞壁的再生、细胞骨架的修复与调整、原生质体分离时细胞所处的周期（G2 期细胞具有较高的分裂频率）。 另外，细胞壁的再生与DNA 的合成协调与否也会影响细胞分裂。 (五)原生质体研究的趋势 低密度和单个原生质体培养；

原生质体衍生系统如微小原生质体、胞质体、核质体的利 用； 单倍配子体如花粉原生质体培养；

计算机控制系统、流式细胞光度计等技术的应用。 19

六 、原生质体变异 一、自发突变

可利用原生质体培养过程中自发变异进行植物遗传改良。 二、原生质体诱变

1）物理诱变剂：中子、γ射线、β射线、χ射线

2）化学诱变剂：5-溴（氟）尿嘧啶、2-氨基嘌呤、亚硝基胍等

第七章 细胞融合与体细胞杂交

第一节 细胞融合

细胞融合，指将两个或两个以上的细胞合并形成一个细胞的技术。

具体步骤：1）两原生质体互相靠近 2）质膜融合形成细胞桥 3）胞质渗透 4）细胞核融合

核融合发生在有丝分裂过程中。

一、融合方法

动物细胞：仙台病毒法、PEG法、电融合法。 植物细胞： PEG法、电融合法。 微生物细胞： PEG法。 1、仙台病毒法

仙台病毒也称日本血凝病毒HVJ，是RNA病毒。 其促进细胞融合的有效部位在于它的膜，被超声波打碎的病毒膜碎片仍具有促进细胞融合的功能。

仙台病毒被膜上相对分子质量为53000的糖蛋白与其促融合的能力相关。 融合步骤：

1）两个原生质体或细胞在病毒黏结作用下彼此靠近。

2）通过病毒与原生质体或细胞膜的作用使两个细胞膜间互相渗透，胞质互相渗透。 3）两个原生质体的细胞核互相融合，融为一体。

4）进入正常的细胞分裂途径，分裂成含有两种染色体的杂种子细胞。 7

仙台病毒法缺点

要提前培养大量病毒。 灭活后才能做融合剂使用。 操作繁琐。

如果灭活不充分，可能感染操作者和亲本细胞。 目前已较少使用该法。 8

2．PEG 诱导融合法

PEG 诱导融合的特点：其优点是融合成本低，无需特殊设备；融合子产生的异核率较高；融合过程不受物种限制。其缺点是融合过程繁琐，PEG 可能对细胞有毒害。

PEG 的作用机理： Kao 等认为，由于PEG 分子具有轻微的负极性，故可以与具有正极性基团的水、蛋白质和碳水化合物等形成H 键，从而在原生质体之间形成分子桥，其结果是使原生质体发生粘连进而促使原生质体的融合；另外，PEG 能增加类脂膜的流动性，也使原生质体的核、细胞器发生融合成为可能。 9

PEG融合注意事项：

1）事先做好两种原生质体的识别标记，如色素、缺陷型、抗性标记。

2）原生质体的密度应在105个/ml左右，两种原生质体按1：1等量混合。

常用PEG分子量4000-6000，加热熔化与Eagle溶液配成50%浓度。加入PEG后，24℃培育10-20min，缓慢加入高PH、高钙离子溶液，15min后用冲洗液清洗，离心收集原生质体。 10

3．电融合法

与PEG 融合比较起来，电融合有三大优点：一是不存在对细胞的毒害问题；二是融合效率高；三是融合技术操作简便。

电融合仪的结构特点：一是交变电场部分；一是高频直流电击部分。 11

电融合的基本过程：

细胞膜的接触：当原生质体置于电导率很低的溶液中时，电场通电后，电流即通过原生质体而不是通过溶液，其结果是原生质体在电场作用下极化而产生偶极子，从而使原生质体紧密

接触排列成串；

膜的击穿：原生质体成串排列后，立即给予高频直流脉冲就可以使原生质膜击穿，从而导致两个紧密接触的细胞融合在一起。

关于融合参数：电融合中的主要参数包括交流电压、交变电场的振幅频率、交变电场的处理时间；直流高频电压、脉冲宽度、脉冲次数等。 12

二、影响原生质体融合的因素 首先，原生质体质量对细胞的融合起着至关重要的作用，高质量的原生质体是细胞融合的首要条件。

其次，融合方法。

其三是融合参数，包括各种融合液都应选择适当。 13

融合参数的选择

PEG融合的关键是作用时间，尤其高钙和高PH溶液的作用时间。过长原生质体损伤严重，融合效率低；过短则不融合。

PEG规格和纯度。4000-6000好；PEG毒性是其中杂质所致，纯化后即无毒。

电融合法与原生质体密度有关，小于104个/ml融合效率低；大于105个/ml，融合成团，难达预期效果。最佳2-8╳104个/ml。 14

融合液中加入少量CaCL2，既可维持一定电导率，对细胞也有保护作用。其次交变电流强弱、处理时间长短、电脉冲大小均会影响融合率。 用混合盐溶液对原生质体进行预处理，以及在促融剂中添加伴刀豆球蛋白、DMSO、胰蛋白酶、精胺、亚精胺等可提高融合率。 15

第二节 体细胞杂交

体细胞杂交：指将不同来源的体细胞融合并使之分化再生、形成新品种的技术。

具体过程：亲本选择，原生质体制备，原生质体融合，融合细胞筛选，细胞壁再生，分裂形成细胞团，愈伤组织，再生杂种植株。 16

一、融合细胞的选择

根据融合细胞中所含的不同，融合后细胞分为： 1）同核体—同源原生质体的融合体。

2）异核体—非同源原生质体的融合体。杂种细胞含有双亲全部细胞核和细胞质物质，其发育的个体也可育。如烟草种间的细胞杂种。

3）多核体—亲源关系较远的细胞间形成的融合体，以一个细胞的核物质为主，只加入另外一个细胞少量的遗传物质。如：胡罗卜与羊角芹形成的部分亲核的杂种细胞。 17

外观选择：利用双亲细胞形态和色泽上的差异识别杂种细胞。 互补选择：遗传互补、抗性互补、生长特性

抗药性筛选法：如亲本A抗卡那霉素，亲本B抗氨苄青霉素；则融合细胞可以在含两种抗生素的培养基上生长，而亲本细胞会死亡。

营养互补筛选法：亲本A为色氨酸缺陷型，亲本B为苏氨酸缺陷型；则融合细胞可以在不含色氨酸和苏氨酸的培养基上培养，而亲本细胞会死亡。 荧光标记选择：无毒荧光素标记双亲原生质体，融合后用电子荧光激活选择器自动分类和选