第五章盐度影响青鳞鱼Ｎａ＋一Ｋ＋－ＡＴＰａｓｅａ、Ｂ和ＧＲ基因表达的研究第五章盐度影响青鲻鱼Ｎａ＋－Ｋ＋－ＡＴＰａｓｅⅡ、Ｂ和ＧＲ基因表达的研究５．１引言迄今为止，有关鱼类渗透压调节的研究，主要集中于广盐性鱼类耐受盐度变化的能力及洄游鱼类由海洋入江河或由江河入海洋过程中渗透压调节的变化等方面。随着分子生物技术的发展，鱼类渗透压调节机制已经由观察鳃丝形态变化，测定鳃丝、肾、肠的Ｎａ＋．Ｋ＋一ＡＴＰａｓｅ活性及血浆Ｎａ＋浓度等，深入到了分子水平的研究。但国内研究鱼类渗透压调节分子机制的报道甚少。国外对鱼类渗透压调节分子机制的研究，主要是针对Ｎａ＋一Ｋ＋－ＡＴＰａｓｅａ、Ｂ、ＧＲ基因的转录、翻译及调控同鳃内氯细胞形态变化、Ｎａ＋．Ｋ＋一ＡＴＰａｓｅ活性的关系”。“。Ｔａｔｓｕｙａ（２００１）、Ｋｏｊｉ（２００３）等报道青鲔鱼可以作为研究渗透压调节机制的模式鱼。“，并且青鲻鱼的基因组计划早已启动”１“，这为研究鱼类渗透压调节的分子机制奠定良好基础。由于本研究室首先克隆了青鲻鱼Ｎａ＋Ｋ＋－ＡＴＰａｓｅａ、Ｂ、ＧＲ基因片段，所以研究盐度对青鳓鱼Ｎａ＋Ｋ＋－ＡＴＰａｓｅａ、Ｂ、ＧＲ基因表达的影响，将为阐明鱼类渗透压调节的分子机制提供科学依据。本文将成年青鲻鱼暴露在千分之十五的盐水中，检测了青鲻鱼鳃、肠、肌肉内Ｎａ＋一Ｋ＋－ＡＴＰａｓｅａ、Ｎａ＋一Ｋ＋－ＡＴＰａｓｅＢ、ＧＲ三个基因表达变化。待青鲻鱼适应较高盐度后，Ｂ、ＧＲ三个基因在鳃、肠、肌肉内的表达变化。转移到淡水中，在不同时间段检测各基因的表达变化。以此来研究渗透压调节过程中Ｎａ＋一Ｋ＋一ＡＴＰａｓｅａ、Ｎａ＋一Ｋ＋一ＡＴＰａｓｅ５．２盐度对青锵鱼鳃、肠、肌肉内Ｎａ＋－Ｋ＋－ＡＴＰａｓｅＱ基因表达量的影响Ｎａ＋一Ｋ＋－ＡＴＰａｓｅａ基因是表达Ｎａ＋一Ｋ＋－ＡＴＰ酶ａ亚基的主要基因。从图５—１可以看出，暴露盐水组鳃、肠和肌肉内Ｎａ＋一Ｋ＋一ＡＴＰａｓｅａ与对照组相比，鳃、肠内受盐度影响Ｎａ＋一Ｋ＋一ｍＴＰａｓｃａｍＲＮＡ水平显著升高，肌肉内无显著变化（尸＜Ｏ．０５）。对照组鳃、肠、肌肉内Ｎａ＋．Ｋ＋－ＡＴＰａｓｅａ的ｍＲＮＡ水平分别为０．００３９１４±０．０００４３５、０．００２２２９±０．００２０９５、０，０００２３４±０．０００１０２（Ｎａ＋．Ｋ十－ＡＴＰａｓｅａ／ＧＡＰＤＨｍＲＮＡ的拷贝数比值，以下类同）。盐水组Ｎａ＋一Ｋ＋－ＡＴＰａｓｅａ的ｍＲＮＡ水平为０．００５５９９±０．０００７２（鳃）、０．０１１７９３±０．００９６１９（肠）、０．０００２５５±ｏ．０００１１８（肌肉）。５．３盐度对青鳝鱼鳃、肠、肌肉内Ｎａ＋一Ｋ＋－ＡＴＰａｓｅＢ基因表达量的影响Ｎａ＋一Ｋ＋一ＡＴＰａｓｃ一ＡＴＰａｓｅＢ基因是编码Ｎａ＋一Ｋ＋一ＡＴＰ酶Ｂ亚基的重要基因。图５．２Ｎａ＋．Ｋ＋Ｂ基因表达，在青鲻鱼适应干分之十五的盐度后，鳃、肠内的表达量无显著性Ｂ变化，肌肉内显著降低（Ｐ＜０．０５）。对照组鳃、肠、肌肉内Ｎａ＋．Ｋ＋－ＡＴＰａｓｅｍＲＮＡ水平为０．２６７９３３±０．１２４９３８，０．３７６７２２１０．１７７８３９，０．１７８６９９±０．０１０２１７。盐水组Ｎａ＋一Ｋ＋一ＡＴＰａｓｅＢ在鳃、肠、肌肉表达量分别是０．３７５１０２±０．０７４０８６、０．６１３８０４±０．２７６１５５、０．０４５１０５±ｏ．０３２６１。Ｎａ＋一Ｋ＋．ＡＴＰａｓｅａ培丑籁旨黎ｖ出—、Ｚ口＾００１｝口ｏｕ０．００１０．０００ｌｇｉｌｌｉｎｔｅｓｔｉｎｅｓｍｕｓｃｌｅ图５?１盐度对青鲻鱼鳃、肠、肌肉内Ｎａ＋一Ｋ＋－ＡＴＰａｓｅａ基因表达的影响ＳＹＢＲ＜Ｏ．０５）。）（实时定量ＲＴ－ＰＣＲ，Ｇｒｅｅｎ荧光染料法（平均值！标准偏差，ｎ＝６），４实验组与对照组相比差异显著（｜口ｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｎｍｕｓｃｌｅ，ｉｎｔｅｓｔｉｎｅａｎｄｇｉｌｌｏｆｍｅｄａｋａｉｎｃｏｎｔｒｏｌａｎｄｓａＩｔｒｅａｌ—ｔｉｍｅＰＣＲ，ＳＹＢＲＧｒｅｅｎＮａ＋－Ｋ＋一ＡＴＰａｓｅ３０５９／Ｌ）ｅｘｐｏｓｅｄｇｒｏｕｐｓｂｙＦｉｇ．５?１ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ（ｍｅａｎ±ｓ．ｎ＾＝６，＋ｐ＜０．０５）．Ｎａ＋一Ｋ＋．ＡＴＰａｓｅ８ｘａｏｕ０．０ｊ１１ａ日；口０．００ｍｌＩＳＣｌｅ图５－２盐度对青鲻鱼鳃、肠、肌肉内Ｎａ＋．Ｋ＋－ＡＴＰａｓｅＢ基因表达的影响（实时定量ＲＴ－ＰＣＲ，ＳＹＢＲＧｒｅｅｎ荧光染料法（平均值！标准偏差，ｎ＝６），＋实验组与对照组相比差异显著（ｐ＜０．０５）。）Ｆｉｇ．５—２Ｎａ＋一Ｋ＋－Ａ１１ＰａｓｅＢｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｎｍｕｓｃｌｅ，ｉｎｔｅｓｔｉｎｅａｎｄｇｉｌｌｏｆｍｅｄａｋａｉｎｃｏｎｔｒｏｌａｎｄｓａＩｔ（１５９／Ｌ）ｅｘｐｏｓｅｄｇｒｏｕｐｓｂｙｒｅａｌ—ｔｉｍｅＰＣＲ，ＳＹＢＲＧｒｅｅｎｄｅｔｅｃｔｉｏｎ（ｍｅａｎ！ｓ．ｎｎ＝６＋Ｐ‘０．０５１．５．４盐度对青鲔鱼鳃、肠、肌肉内ＧＲ基因表达量的影响ＧＲ基因是编码糖皮质激素受体的重要基因。图５—３ＧＲ基因表达，在青鳊鱼适应千分之十五的盐度后，鳃内的表达量显著升高，肌肉内显著降低，肠内无显著变化（Ｐ＜０．０５）。对照组鳃、肠、肌肉内Ｎａ＋．Ｋ＋．ＡＴＰａｓｅＢｍＲＮＡ水平为０．０００２７３＿＋０．００００４９，第五章盐度影响青鳓鱼Ｎａ＋－Ｋ＋－ｈＴＰａｓｅｄ、Ｂ和ＧＲ基因表达的研究３１Ｏ．０００１９６±０．００００６５，０．０００２７３±０．００００８。盐水组ＧＲ在鳃、肠、肌肉表达量分别是０．０００８４９±０．００１３５６、０．０００２６±０．０００２０８、０．０００１６７±ｏ．００００２７。Ｏ．０１０．００１０．０００ｍｕｓｃｌｅ图５－３盐度对青鳓鱼鳃、肠、肌肉内ＧＲ基因表达的影响（实时定量ＲＴ－ＰＣＲ，ＳＹＢＲＧｒｅｅｎ荧光染科法（平均值±标准偏差，ｎ＝６），’实验组与对照组相比差异显著（ｐ＜０．０５）。）Ｆｉｇ．５－３ＧＲｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｎｍｕｓｃｌｅ，ｉｎｔｅｓｔｉｎｅａｎｄｇｉｌｌｏｆｍｅｄａｋａｉｎｃｏｎｔｒｏｌａｎｄｓａｌｔ（１５９／Ｌ）ｅｘｐｏｓｅｄｇｒｏｕｐｓｂｙｒｅａｌ—ｔｉｍｅＰＣＲ，ＳＹＢＲＧｒｅｅｎｄｅｔｅｃｔｉｏｎ（ｍｅａｎ±ｓ．Ｄ．ｎ＝６＋Ｐ（ｏ．０５１．５．５青鲔鱼适应千分之十五盐度后，转入淡水，鳃内不同时间Ｎａ＋－Ｋ＋－ＡＴＰａｓｅＱ基因表达量的变化图５—４青鳓鱼适应千分之十五盐度后，转入淡水，鳃内不同时间段Ｎａ＋一Ｋ上．ＡＴＰａｓｅｍⅡ玎ｎＫ塔ｍＫｍｍＫＨ兽｛ｕ墨叮图５－４青鲻鱼转入淡水鳃内Ｎａ＋．Ｋ＋－ＡＴＰａｓｅａ基因在不同时间段表达变化（实时定量ＲＴ－ＰＣＲ，ＳＹＢＲＧｒｅｅｎ荧光染料法（平均值±标准偏差，Ｈ＝６），＋实验组与盐水组相比差异显著（｜Ｄ＜０．０５）。）Ｆｉｇ．５－３Ｎａ＋一Ｋ＋－ＡＴＰａｓｅｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｎｇｉｌｌｏｆｍｅｄａｋａｉｎｓａｌｉｎｉｔｙａｎｄｄｉｆｆｅｒｅｎｔｔｉｍｅｏｆｍｏｖｅｄｆｒｅｓｈｗａｔｅｒｇｒｏｕｐｓｂｙｒｅａｌ－ｔｉｍｅＰＣＲ，ＳＹＢＲＧｒｅｅｎｄｅｔｅｃｔｉｏｎ（ｍｃａｎ！ｓ．Ｄ．ｎ＝６＋Ｐ＜０．０５）．３ａ基因表达的变化。青鲻鱼适应１５９／Ｌ盐度后转入淡水１２小时，Ｎａ＋．Ｋ＋－ＡＴＰａｓｅａ基因３２青辩鱼鳃内Ｎａ。＿Ｋ’一ＡＴＰａｓｅ基因的克隆及皮质醇对其表达的影响表达量显著降低。Ｎａ＋－Ｋ＋－ＡＴＰａｓｅａ基因在３ｈ的表达量为０．００４４７１＋０．０００８０２、１２ｈＯ．００２７８８＿＋０．０００８６７、０．００３７５±ｏ．０００８３６。２４ｈＯ．００３８２８＿＋０．０００４７５、４８ｈ０．００３９０７＿＋０．０００５５７、９６ｈ５．６青鲔鱼适应千分之十五盐度后，转入淡水，鳃内不同时间Ｎａ＋－Ｋ＋－ＡＴＰａｓｅｐ基因表达量的变化图５—５青鲻鱼适应干分之十五盐度后，转入淡水，鳃内不同时间段Ｎａ＋一Ｋ＋一ＡＴＰａｓｅＢ基因表达的变化。Ｎａ＋－Ｋ＋一ＡＴＰａｓｅ１３基因在３ｈ的表达量为０．２３３１１＿＿．０．０３０７４、１２ｈ０．２２７５９５－＋０．０９５６０１、２４ｈＯ．２７９４５７＿＋０．０７１４１９、４８ｈ０．３６６６９４＿＋０．１８９８３４、９６ｈ０．４５５８６５＿！－０．２４５７６２。蛩｝?ｏＮａ＋．Ｋ＋．ＡｒＰａｓｅＢＯ０ｉｍＯ图５－５青鳓鱼转入淡水鳃内Ｎａ＋．Ｋ＋－ＡＴＰａｓｅＢ基因在不同时间段表达的影响（实时定量ＲＴ－ＰＣＲ，ＳＹＢＲＧｒｅｅｎ荧光染料法（平均值！标准偏差，ｎ＝６），＋实验组与盐水组相比差异显著（口（０．０５）。）Ｆｉｇ．５—３Ｎａ十－Ｋ＋－ＡＴＰａｓｅ８ｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｎｇｉｌｌｏｆｍｅｄａｋａｉｎｓａｌｉｎｉｔｙａｎｄｄｉｆｆｅｒｅｎｔｔｉｍｅｏｆｍｏ．ｖｅｄｆｒｅｓｈｗａｔｅｒｇｒｏｕｐｓｂｙｒｅａｌ＿ｔｉｍｅＰＣＲ，ＳＹＢＲＧｒｅｅｎｄｅｔｅｃｔｉｏｎ（ｍｅａｎ±＆Ｄ．ｎ＝６‘Ｐ＜０．０５、．００ｉ０００ｌ０．０００１日０００００ｌｃｏｎｔｒｏｌｓａｌｉｎｉｔｙ３ｈｌ２ｈ２４ｈ４８ｈ９６ｈ图５－６青鲻鱼转入淡水鳃内ＧＲ基因在不同时间段表达的影响（实时定量ＲＴ－ＰＣＲ，ＳＹＢＲ荧光染料法（平均值！标准偏著，ｎ＝６），４实验组与盐水组相比差异显著（ｐ（０．０５）。）ＧｒｅｅｎＦｉｇ?５－６ＧＲｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｎｇｉｌｌｏｆｍｅｄａｋａｉｎｓａｌｉｎｉｔｙａｎｄｄｉｆｆｅｒｅｎｔｔｉｍｅｏｆｍｏｖｅｄｆｒｅｓｈｗａｔｅｒｇｒｏｕｐｓｂｙｒｅａｌｌｔｉｍｅＰＣＲ，ＳＹＢＲＧｒｅｅｎｄｅｔｅｃｔｉｏｎ（ｍｅａｎ！Ｓ．Ｄ．＾＝６＋Ｐ＜０．０５）．