第四章Ｎａ＋－－Ｋ＋－ＡＴＰａｓｅｏ、Ｓ和ＧＲ基因在青鳓鱼组织内表达的研究第四章Ｎａ＋－Ｋ＋－ＡＴＰａｓｅＱ、１３和ＧＲ基因在青锵鱼组织内表达的研究４．１引言很多研究工作的结果表明，由Ｎａ＋．Ｋ＋．ＡＴＰａｓｅ维持的离子梯度差有重要生理意义。Ｎａ＋．Ｋ＋－ＡＴＰａｓｅ能够维持细胞的膜电位，成为可兴奋细胞，如神经、肌细胞等的活动基础，调节细胞的体积和驱动某些细胞中的糖和氨基酸的运送。“。Ｃｕｔｌｅｒ（１９９５）、Ｒａｊａｒａｏ（２００１）、Ｂｌａｓｉｏｌｅ（２００３）、一ＡＴＰａｓｅＥｄｄｉｅ（２００５）等研究表明鱼类的Ｎａ＋一Ｋ＋．ＡＴＰａｓｅａ和Ｎａ＋．Ｋ＋Ｂ基因表达同Ｎａ－｝－Ｋ＋一ＡＴＰａｓｅ活性相关“。““”。Ｍａｕｌｅ（１９９１）、Ｐｒｉｃｅ（１９９４）、Ｄｕｃｏｒｅｔ（１９９５）、Ｍａｔｈｉｌａｋａｔｈ（２００３）等研究报道糖皮质激素受体（ＧＲ）对调节体内糖代谢、抑制机体免疫力、调节渗透压等起重要作用‘一”。所以研究ＧＲ基因在青鳞鱼各个组织内的转录情况有重要意义。实时定量ＰＣＲ，是指在ＰＣＲ指数扩增期间通过连续监测荧光信号的强度来即时测定特异性产物的量，并据此推断目的基因的初始量旧３。具有很高的敏感性、重复性和特异性。本文用荧光实时定量ＲＴ—ＰＣＲ方法，检测了Ｎａ＋．Ｋ＋－ＡＴＰａｓｅａ、Ｎａ＋．Ｋ＋－ＡＴＰａｓｅＢ和ＧＲＺ个基因在鳃、脑、眼睛、肠、肌肉、肝和脾内的表达情况，旨为进一步研究三个基因表达量和其功能的关系提供基础数据。４．２Ｎａ＋－Ｋ＋－ＡＴＰａｓｅ、Ｑ基因在青鲔鱼不同组织内的表达量ｘ１０４（Ｎａ＋．Ｋ＋青鳓鱼鳃内Ｎａ＋．Ｋ＋一ＡＴＰａｓｅａ的ｍＲＮＡ水平为３．９１ｘ１０’３±４．３５一ＡＴＰａｓｅａ，ＧＡＰＤＨｍＲＮＡ的拷贝数比值，以下类同）。肌肉、肠、肝、脑、眼睛、脾内的ｍＲＮＡ水平分别为２．３４ｘ１０’４±１．０２ｘ１０４、２．２３ｘｌｏ‘３＋－２．１０ｘｌｆｆ３、２．１７×ｌｆｆ３＋－８．８９×１ａｒ４、２．１ｘ１０－５±１．０ｘ１０～、３．６ｘ１０－５－＋０．６ｘ１０～、５．２２×１０１４－＋１．Ｏｌｘｌ０４。结果表明，Ｎａ＋．Ｋ＋－ＡＴＰａｓｅａ在青鳞鱼鳃、肌肉、肠、肝、脑、眼睛和脾内都表达，其表达量是鳃＞肠一肝＞脾＞肌肉＞眼睛＞脑（图４．１）。４．３Ｎａ＋－Ｋ＋－ＡＴＰａｓｅＢ基因在青鲔鱼不同组织内的表达量青鳓鱼鳃内Ｎａ＋．Ｋ＋．ＡＴＰａｓｅＢ的ｍＲＮＡ水平为０．２７±Ｏ．１２。肌肉、肠、肝、脑、眼睛、脾内的ｍＲＮＡ水平分别为Ｏ．１８＿＋０．０１、０．３８＿＋０．１８、０．１５－＋０．０２、３．１３ｘ１０’２±１．０１ｘ１０～、４．１９ｘ１０。±１．５２ｘ１０－２、０．３１＿＋０．１２。本研究用实时定量ＲＴ—ＰＣＲ测定了Ｎａ＋一Ｋ十．ＡＴＰａｓｅＢ基因在青鲻鱼七种组织中的表达情况，如同４—２所示。结果表明Ｎａ＋．Ｋ＋．ＡＴＰａｓｅＢ基因在各组织中均有表达，鳃、肠、脾内表达强烈，尤其是肠中：而脑和眼睛中表达微弱。Ｎａ＋．Ｋ＋．ＡＴａｓｅＢ基因在各组织中表达强弱顺序是肠＞脾＞鳃＞肌肉一肝＞眼睛＞脑。２６青鳓鱼鲤内Ｎａ‘－Ｋ。ＡＴＰａｓｅ基因的克隆及皮质醇对其表达的影响疆ｌＯ．０【粤Ｏ．００ｌ０．０００１０．００００１ｊＩｌ口日ｎｂｇｉｌｌⅡｕｓｃｌｅｉｎｔｅｓｔｉｎｅｓｌｉｖｅｒｂｒａｉａｅｙｅｓｐｌｅｅｎ图４－１青鳓鱼鲤、肌肉、肠、肝、脑、眼睛和脾内Ｎａ＋．Ｋ＋－ＡＴＰａｓｅａ基因的表达量（实时定量ＲＴ－ＰＣＲ，ＳＹＢＲＧｒｅｅｎ荧光染料法（平均值！标准偏差，ｎ＝６））。Ｆｉｇ．４—１Ｎａ＋一Ｋ＋－ＡＴＰａｓｅａｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｎｓｐｌｅｅｎ，ｅｙｅ，ｂｒａｉｎ，ｌｉｖｅｒ，ｉｎｔｅｓｔｉｎｅｓ，ｍｕｓｃｌｅａｎｄｇｉｌｌｏｆｍｅｄａｋａｂｙｒｅａｌ‘ｔｉｍｅＰＣＲ，ＳＹＢＲＧｒｅｅｎｄｅｔｅｃｔｉｏｎ（ｍｅａｎ！ｓｎｎ＝６１．趔《羹鼋１０蕤蚕荤呈≮差艺迁Ｏ譬１＝▲‘Ｏ．１高童导０．０ｌｇｉｌｌｍｕｓｃｌｅｉｎｔｅｓｔｉｎｅｓ１ｉｖｅｒｂｒａｉｎ图４－２青鲻鱼鳃、肌肉、肠、肝、脑、眼睛和脾内Ｎａ４－＿Ｋ＋－ＡＴＰａｓｅＢ基因的表达量（实时定量ＲＴ－ＰＣＲ，ＳＹＢＲＧｒｅｅｎ荧光染料法（平均值！标准偏差，ｎ＝６））。Ｆｉｇ．４—２Ｎａ＊－Ｋ＋－ＡＴＰａｓｅＢｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｎｓｐｌｅｅｎ，ｅｙｅ，ｂｒａｉｎ，ｌｉｖｅｒ，ｉｎｔｅｓｔｉｎｅｓ，ｍｕｓｃｌｅａｎｄｇｉｌｌｏｆｍｅｄａｋａｂｙｒｅａｌ－ｔｉｍｅＰＣＲ，ＳＹＢＲＧｒｅｅｎｄｅｔｅｃｔｉｏｎ（ｍｅａｎ！ｓ．Ｄ．ｎ＝６）．４．４ＧＲ基因在青鳙鱼不同组织内的表达量图４．３青鲔鱼鳃内ＧＲ的ｍＲＮＡ水平为２．７３ｘ１０。４±４．９ｘ１０～。肌肉的ｍＲＮＡ水平分别为２．７３ｘｌＯ’４±８．０ｘ１０～、肠１，９６ｘ１０。±６．５ｘ１０～、肝２．２８ｘ１０一±１．９ｘ１０’４、脑７．１ｘ１０—５±２．１ｘ１０一、眼睛８．１ｘ１０‘５±５．３ｘ１０‘‘、脾３．２４ｘ１０。４１１．２１ｘ１０＋４。即鳃＞肠一肝＞脾＞肌肉＞眼睛＞脑。ＧＲ在肝和脾内表达量较高。第四章Ｎａ＋一Ｋ＋－ＡＴＰａｓｅｎ、Ｓ和ＧＲ基因在青鳞鱼组织内表达的研究ｎ㈣㈣０舢㈣ｍ图４－３青鳓鱼鳃、肌肉、肠、肝、脑、眼睛和脾内ＧＲ基因的表达量（实时定量ＲＴ－ＰＣＲ，ＳＹＢＲＧｒｅｅｎ荧光染料法（平均值±标准偏差，Ⅳ＝６））。Ｆｉｇ．４?３ＧＲｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｎｓｐｌｅｅｎ，ｅｙｅ，ｂｒａｉｎ，ｌｉｖｅＬｉｎｔｅｓｔｉｎｅｓ，ｍｕｓｃｌｅａｎｄｇｉｌｌｏｆｍｅｄａｋａｂｙｒｅａｌ－ｔｉｍｅＰＣＲ，ＳＹＢＲＧｒｅｅｎｄｅｔｅｃｔｉｏｎ（ｍｅａｎ±ｓ．Ｄ．ｎ＝６１．４．５讨论本文对青鳝鱼Ｎａ＋一Ｋ＋－ＡＴＰａｓｅａ、Ｎａ＋一Ｋ＋－ＡＴＰａｓｅＢ、ＧＲ三个基因在鳃、脑、眼睛、ａ、Ｎａ＋一Ｋ＋．ＡＴＰａｓｅ肠、肌肉、肝和脾内的表达进行了研究。结果表明，Ｎａ＋一Ｋ＋．ＡＴＰａｓｅＢ、ＧＲ三个基因在鳃、脑、眼睛、肠、肌肉、肝和脾内皆表达，每个基因在不同组织内表达量各异。由于Ｎａ＋．Ｋ＋．ＡＴＰａｓｅ达量和组织功能密切相关。广盐性硬骨鱼类鳃、头肾和肠对渗透压调节起重要作用ｏ…，但是本研究因青鲔鱼体积太小，未分离到头肾。本文实验结果表明，Ｎａ＋．Ｋ＋－ＡＴＰａｓｅａ、Ｎａ＋一Ｋ＋．ＡＴＰａｓｅ８和ＧＲ基因在青鲔鱼鳃和肠内表达量较高，与鳃和肠在调节体内渗透压起重要作用的功能相一致。因为肌肉含水量随血液浓度变化，所以通常被作为检测鱼类渗透压调节能力的指标。Ｍａｄｓｅｎ（１９９０）、Ｊｅｎｓｅｎ（１９９８）、Ｋｅｌｌｙ（１９９９）、Ｔａｔｓｕｙａ（２００１）等报道了，肌肉含水量同鱼体血浆渗透压、钠离子浓度和鳃内氯细胞数成正相关“’“６７’…。Ｎａ＋一Ｋ＋．ＡＴＰａｓｅ是维持肌细胞内外离子动态平衡的关键性酶晴９１，图４．１、４－２、４－３显示肌肉内Ｎａ＋．Ｋ＋一ＡＴＰａｓｅａ、Ｎａ＋一Ｋ＋一ＡＴＰａｓｅａ、Ｎａ＋．Ｋ＋，ＡＴＰａｓｅＢ、ＧＲ基因是功能基因，所以其表Ｂ和ＧＲ基因的表达水平均处于中等（同在其他组织内表达水平相比），为ａ、Ｎａ＋．Ｋ＋－ＡＴＰａｓｅ研究Ｎａ＋．Ｋ＋－ＡＴＰａｓｅ变奠定了基础。Ｂ和ＧＲ基因表达的变化，是否引起肌肉含水量改图４．３表明，ＧＲ基因在青鲻鱼的肝和脾内表达水平也较高。Ｄｕｃｏｒｅｔ（１９９５）、Ｍａｔｈｉｌａｋａｔｈ（２００３）等研究表明，皮质醇主要作用还可以控制糖代谢，抑制机体免疫力“２’６”。肝是糖代谢的主要器官，脾是最大的免疫器官，因此ＧＲ基因在这两个器官内有较高的表达这同其功能是一致的。此实验结果为研究环境胁迫引起鱼类免疫抑制、增强糖青鳞鱼鳃内Ｎａ＋－Ｋ７＿ＡＴＰａｓｅ基因的克隆及皮质醇对其表达的影响代谢等提供了基础数据。从图４．１、４．２、４．３可以看出，Ｎａ＋．Ｋ＋．ＡＴＰａｓｅ．ａ、Ｎａ＋一Ｋ＋．ＡＴＰａｓｅＢ、ＧＲ－－－个基因在青鲻鱼脑内的表达水平皆最低。但钠钾离子泵（Ｎａ＋．Ｋ＋－ＡＴＰａｓｅ）对神经细胞的兴奋起关键作用。硬骨鱼类体内不分泌醛固酮类激素，只产生糖皮质激素，所以糖皮质激素受体对硬骨鱼类内分泌调节十分重要”１。所以Ｎａ＋．Ｋ＋－ＡＴＰａｓｅａ、Ｎａ＋．Ｋ＋－ＡＴＰａｓｅＢ、ＧＲ基因在青鲻鱼脑内表达，将为在分子水平上研究脑与鱼类繁殖等生命行为的关系，积累基础资料。４．６本章结论本文的实验结果表明，Ｎａ＋一Ｋ＋－ＡＴＰａｓｅａ、Ｎａ＋．１ｒ—ＡＴＰａｓｅＢ、ＧＲ－－三个基因在鳃、脑、眼睛、肠、肌肉、肝和脾内都表达。Ｎａ＋．ＩＣ．ＡＴＰａｓｅａ在青鲻鱼组织内表达水平是鳃＞肠一肝＞脾＞肌肉＞眼睛＞脑（图４．１），Ｎａ＋．Ｋ＋－ＡＴＰａｓｅＢ基因在各组织中表达强弱顺序是肠＞脾＞鳃＞肌肉一肝＞眼睛＞脑（图４．２），ＧＲ基因表达量是鳃＞肠。肝＞脾＞肌肉＞ｌＩＥ睛＞脑（图４—３）。本章的研究结果可以为研究鱼类渗透压调节、免疫抑制、神经细胞兴奋的分子机制等提供基础数据。