ｔ６青鲚鱼鳃内Ｎａ。Ｋ‘－ＡＴＰａｓｅ基因的克隆及皮质醇对其表达的影响７３０７４０７ＳＯ７６０ｎｍｔｌＨｌｌ坪ｈｅｔｅｚｏｃｌｉｔｚｚｓＤ，衄ｔ２０ｚｅｚｉｏｆｚ曲ｒ丑￡ｍＪｆｊｉｌｌ７１２７１４７１２７１２７１７＇１８助ａｂｄ００ａｉｇ￡￡ｇ，ａｚ蚰ｆｓｐａｊｕＦＤｚ”ｔ０１ｄｇ口，ｃｕｏＪｃｃｕｌｕ＃拗脚ｓａｐｉｅａｓ伪加蝴Ｊｃ砬∞ｚｈ，础ｉｌＪ目ＦＩ：ｉＪ?ｔｚ，ｘ／ｎｂｏ‘ｆ＿曲由Ｆ乜ｎｄⅡ２狮矗ｅｔｅｘｏｃＺｉ％噼仕ｉ１１ＤａＤＪ．ｏ７９２７９ｑ７９２７９２７９７７９８ｚｅｚｉｏ（ｚｅｂｚａｆｉ２ｈ，鼬ａｂ如相珂ＨＦ朋功ｄｆ印ａｚⅡＦａｔ”ｔ０１ｄ舛ＦｃⅡ吐ｃｎｌ￡ｌＪｆｒａｂ由矗Ｄ■∞ＦａｐｉｅｎＪＯｔｔｃｏｉ自，ｎｃ妇口吐ｉｌ，ｔｚａｉⅡｂｏｆＡＨ日衄ＪＦｕｎｄｕ２ｔｚｅＤａ缸ｏｚｅｚｉｏ（ｚｅｂｚａｆｉｓｈ，８７ｑ８７２砌丑ｂｄｏ柏ｚｇ口Ｆ＃ａｚｂａｆ∈砸ａ功ｇｏｆｙｃｔ０１ｄ卵Ｆｃ嘶ｃｉｌｌｌｚ５ｆｊａｈ扫８７２ｈｅｔｅｚｏｃｌｉ妇“：ｉｌｌ８７２‘抽ｃｏｉｈ，Ｉ袖Ｈｊ月噼ｉ，，ｆＪａｉｎｂＤ丑。瑚Ｊａｐ王ｅｌｌ０ｆｈｎｍａｎＪ８７７８７８Ｆ田瓢ｌａｌⅡＦ矗ｅｅｅｘｏｃｌｉｔｕｓ朋：ｉ１１９５２９５ｑ９５２９５２９５７９５８ｚｅｒｏ伍ｅｂｚ４￡ｉ础Ｊ劢曲ｄｏＦｄｚ卵ＦＦａｉｊｂａ‘ｓｐａｉｔ博ＤａｎｉｏＯ—掣￡０１?｝ｇⅡｔｃ皿ｃ‘吐ｕＦｆｚａｈ扫伽ｃｏｚｈｙＥ曲ｌｚ，日噼ｉ，，ｆｍ●加ｌｈｎｍａｎ，月ｂ肿ｓａｐｉｅｎｓ圈３－１人（ＢＣ０９４８０１）、海鲷（ＡＹ５５３２０５）、兔子（ＡＦ２３５０２４）、虹鳟（ＡＹ３１９３９０）、底鳓（ＡＹ０５７０７２）及斑马鱼（ＡＹ００８３７５）Ｎａ＋．１（＋－ＡＴＰａｓｅａ氨基酸序列比对图．‘‘垂｝’表示该区域不同物种间氨基酸序列完全相同；“垂”表示该区域不同物种间氮基酸序列具有同源性．Ｆｉｇ．３－１Ｍｔｔｌｔｉｐｌｅｓｅｑｕｅｎｃｅａｌｉｇｎｍｅｎｔｏｆｔｈｅａｍｉ．ｏａｃｉｄｓｅｑｒｄｅｌｌｇｇｏｆＮａ＋－Ｋ＊．ＡＴＰａｓｅａｉｎｚｅｂｒａｆｉｓｈｆＤａｎｉｏｒｅｒｉｏ，ＡＹ００８３７５），ｋｉｌｌｆｉｓｈ（Ｆｕｎｄｕｌｕｓｈｅｔｅｒｏｃｌｉｔｕｓ，ＡＹ０５７０７２），ｒａｉｎｂｏｗ（Ｏｎｃｏｒｈｙｎｃ＾∞ｎｙｋｉｓｓ，ＡＹ３１９３９０），ｒａｂｂｉｔ（Ｏｒｙｃｔｏｌａｑｕｓｓａｒｂａ，ＡＦ２３５０２４），Ｓｐａｒｕｓｓａｒｂａ（Ｒｈａｂｄｏｓａｒｇｕｓｓａｒｂａ，ＡＹ５５３２０５）ａｎｄｈｕｍａｎ（Ｈｏｍｏｓａｐｉｅｎｓ，ＢＣ０９４８０１）．Ｔｈｅ‘臂’ｉｎｄｉｃａｔｅｄｉｄｅｎｔｉｃａｌｒｅｇｉｏｎａｎｄ“氍”ｉｎｄｉｃａｔｅｄｒｅｌａｔｉｖｅｌｙｃｏｎｓｅｒｖｅｄｒｅｇｉｏｎ．笙三兰至旦塞堡兰堡型坌堑！：１１１０１１２０１１３０１１４０１１ＳＯ胁ｄｎｌ附Ｉ皓抽朋ｃｌｉ￡Ⅱ口ｆＪ：ｎ１１０７７Ｄ硼ｔｆｉＬＯ地ｆｉ０ｆｚｅ扫ｆａ￡“国，１０８０助ｄ凼ｄｏ舱ｊ驰ＦＯｚｙｃＰ，ｏＺ删ｃＥ旺ｃ咀吐，ｆｚａ抽ｗａｚｂａｔ印ａｚｚｚｓ１０７７１０７７同哪Ｆ啦ｅｎＦｏＲ∞吐，ｎｄｍＦ届，’量ｉ，Ｆｆｚａｎｔ晰１０９２ｆｈ珈％曲，１１Ｄ１Ｆ硼∞血１ｔ墉２皓ｔｅｒｏｃＩｉ￡≈博（ｋｉｌｌ１１２＇Ｄａｘｌｉｏ殛?ｔｂ由量ｔ学●牡曲ａ矗；ｐｔ珊Ｚｅｚｉｏ｛ｚｅ，ｂｚａ．ＦＪ上ｈＪ１１３０１１２７ＯｚＩｐｃｔ；ｏｌａｇｏＪｒｃ叽ｉｃ皿ｉ捃ｆｚａ曲１１２７ＯｎｃｏｚｈｙｎｃｈＨｍｌ聃ｉｅｓｔｚａｉｎｂｏ１ｌｑ２丑哪Ｆ?ｔｐｊｅｎｊｆｈⅡ日ｔ衄，１ｉ５１Ｆ田砌缸ｌｔ硝ｈｅ．ｚ００１ｉｔａｇ¨：ｉ１１口ａ珏ｉｏＫｅ上ｉｏｆｚｅ扫ｚａ￡汝，１１１１ｉ１８０Ｊｍ?ｉｂｄｏ舱ｚｇ丑？ｗａｚｂａｆ５Ｐ正珊１１７７ＯＺ，ｃｔ；ｏｌａｇｚｚ＃ｃａｎ王ｃⅡ１Ｈ，ｆｒａｈｂｃｈｃｏ茧啪曲Ｈｇ月Ｉ嚏ｉｇ，ｔｒａ捌ｂｏ１１７７１１９２ｊｂ盈Ｄ，ｄｐ王ｅｎｆｆ矗８ｍ蕾ｌ，ｉ２０１ｆ嘲８ｌ砰２皓￡ｃＪ口出￡留ｆ｜：ｉ１１１２２７ＤａｚＬｉｏ船工ｉｏＩｚＰ－．ｂｚａ．Ｃ：ＬｇｈＪ１２３０助ｄ由ｄｏＦａＪ９田ｇＦａ曲ａ抽蕾ｄ瑚１２２７ｎｆ】吧ｔ０１ａｇ研ｃｍｒｌｉｃａｌｕａＯａｅｏｘ／ｔｙｕｃ／ｍｓ月Ⅲ掌０ｆｚａｂ扫１２２７ｆｚａｉ丑ｂｏｌＺ４２／－／ｏ瑚ＦａＤｉ曲ｇｆｈⅡｎ衄Ｊ１２５１Ｆ妇ｄｕＺｎＦ＾ｅｔｅ■ｏｃｌｉｔＨＦ阻１１２９ＺｑＤａ／Ｌｉ－ｏ肥ｆｉ０（ｚｅｂ￡ａｆ－ＬｓｈｌＺ９３０Ｒｈａｈｄｏ矗ａＪ冒Ｈ０ｃｕｎＪ．ｃｕ埘（ｚａｂｂｓａｚｂａｆ印ａｒｚｚＦ２９２４ｏ玎吧￡０１ａ扣０ｏ呦ｚ，岬曲ＨＦ＾擎ｔｉＦＦ２９２ｑ‘ｆ正ｉｎｂｏＺ９３９￡白矗ＤＦａｐｉ凹０ｆ矗口商ａｎ，Ｚ９４２ｆ扛ＲｄｕｉｌｚＦ矗ｅ￡ｅｚｏｃ上ｉｔｌｉ●（ｋｊ－１１２９７ｑＤａｎｉｏｆｅｄｏｌｚｅｂｆａ王ｉｏｈ’２９８０，ｍａｂｄｏｓａｆｇ阻ｏｓａｚｂａｆ印ａ．ｎｚＦ２９７＇Ｉ。蚴ｊ五ｙ丑曲ⅡｆＯｚｙｃｔ，ｏｌａｇ珊ｌｃ口Ｅ嚏ｃ翔ｄ￡Ｌ，ｆｎ岫２９７４ｊ蟹ｔｉ曩Ｆｆ皿血ｔｂｏ２９６５＇丑ｂｚ岫ｓａｊｐ．ｉｅａｓｆｈＨ商衄Ｊ２９９２图３－２人（ＢＣ０９４８０１）、海鲷（ＡＹ５５３２０５）、兔子（ＡＦ２３５０２４）、虹鳟（ＡＹ３１９３９０）、底鲻（ＡＹ０５７０７２）及斑马鱼（ＡＹ００８３７５）Ｎａ＋．Ｋ＋．ＡＴＰａｓｅａ的基因序列比对图及其兼并引物的设计．‘‘圈”表示该区域不同物种间核酸序列完全相同口和二Ｉ：分别代表两对引物设计区域．Ｆｉｇ．３，２Ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅｐｒｉｍｅｒｏａｉｒｓｄｅｓｉｇｎｍｅｎｔｂａｓｅｄｏｎｍｕｌｔｉｐｌｅｓｅｑｕｅｎｃｅａｌｉｇｎｍｅｎｔｏｆｔｈｅｎｕｃｌｅｉｃａｃｉｄｓｅｑｕｅｎｃｅｏｆｌｑａ＋－Ｋ＊－ＡＴＰａｓｅａｉｎｚｅｂｒａｆｉｓｈ（Ｄａｎｉｏｒｅｒｉｏ，Ａ：Ｙ００８３７５），ｋｉｌｌｆｉｓｈ（Ｆｕｎｄｕｌｕｓｈｅｔｅｒｏｃｌｉｔｕｓ，ＡＹ０５７０７２），ｒａｉｎｂｏｗ（Ｏｎｃｏｒｈｙｎ曲ｕｓｎｙｋｉｓｓ，ＡＹ３１９３９０），ｒａｂｂｉｔ（Ｏｒｙｃｔｏｌａｑｕｓｓａｒｂａ，ＡＦ２３５０２４），Ｓｐａｒｕｓｓａｒｂａ（Ｒｈａｂｄｏｓａｒｇｕｓｓａｒｂａ．ＡＹ５５３２０５）ａｎｄｈｕｍａｎ（Ｈｏｍｏｓａｐｉｅｎｓ，ＢＣ０９４８０１）．Ｔｈｅ‘‘霉’ｉｎｄｉｃａｔｅｄｉｄｅｎｔｉｃ、ａｌｒｅｇｉｏｎ．口ａｎｄ二．＝ａｒｅｒｅｇｉｏｎｓｔｈａｔｄｅｇｅｎｅｒａｔｅｐｒｉｍｅｒｐａｉｒｓｄｅｓｉｇｎｅｄ．从图３．２上两对框定区域，本研究设计兼并引物１８青鲻鱼鳃幽Ｎａ。Ｋ’－ＡＴＰａｓｅ基因的克隆及皮质醇对其表达的影响同义５’－ＡＴＧＡＣＮＧＴＮＧＣ［Ｃ／Ｔ］ＣＡＣＡＴＧＴＧＧＴＴ－３’反义：５＇－ＧＴＡＮＧＧＮＡＡＧＧＣＡＣＡ［ＧＡ］ＡＡＣＣＡＣＣＡ－３其他克隆青鳞鱼基因所用兼并弓ｌ物序列均列于表３－１。表ｏ－１克隆青鳙鱼基因所用兼并引物序列．Ｔａｂ．３－１Ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅｐｒｉｆｉｌｅｒ＂ｐａｉｒｓｏｆｍｅｄａｋａｇｅｎｅｓｆｏｒＣＩｏｎｅ．基因片段的ＰＣＲ扩增与克隆ＰＣＲ反应液（５０ｐ１）：１“ｌｃＤＮＡ，１×ＰＣＲＢｕｆｆｅｒ（１０ｍＭＫＣｌ；１．５ｍＭＴｒｉｓ—ＨＣＩ，ｐＨ８．３：５０ｍＭｒａｉｎ；Ｍｇｃｌ２），０．２ｍＭｄＮＴＰ，０。４群Ｍ引物。ＰＣＲ反应条件：９５４Ｃ变性１Ｓ，５３。Ｃ４０Ｓ，７１＂（２６０４０循环：９５℃４０凝胶进行电泳。Ｓ；７２。Ｃ延伸８ｍｉｎ。ＰＣＲ产物用１．５％琼脂糖采用Ｗｉｚａｒｄ＠ＰＣＲＰｒｅｐｓＤＮＡＰｕｒｉｆｉｃｔｉｏｎＳｙｓｔｅｍ纯化凝胶中ＤＮＡ条带。纯化产物送大连宝生物公司测序（ＡＢＩＰＲＩＳＭＴＭ３７７ＸＬ型测序仪）。青鳎鱼鳃内Ｎａ＋．Ｋ＋一ｆｌｘＴＰａｓｅａ基因序列分析如图３－４所示，本文克隆了６５０个碱基的Ｎａ＋．Ｋ＋－ＡＴＰａｓｅａ基因序列，对应２１６个氨基酸。将核苷酸序列在基因文库网站中比对，比对常用网址：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／，选择“Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ—ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅＢＬＡＳＴ佃ｌａｓｔｎ）”进行比对。网上比对证明所得基因序列是预期的目标基因。此外有些时候，如果测序出现套峰，可以通过比对确定最可能的碱基。将获得ＤＮＡ序列按照三联体密码子翻译成蛋白序列，进行蛋白序列比对，以进一步研究蛋白同源性。…。Ｓｅｑｕｅｎｃｅ非鱼（ＯｒｅｏｃｈｒｏｍｉｓＩｄｅｎｔｉｔｙＭａｔｒｉｘ分析发现，青鲻鱼Ｎａ＋．Ｋ＋．ＡＴＰａｓｅａ和罗ａ氨基酸序列有９０％相ｍｏｓｓａｍｂｉｃｕｓ，ＡＡＤｌｌ４５５１Ｎａ＋一Ｋ＋．ＡＴＰａｓｅ同，与海鲷（Ｒｈａｂｄｏｓａｒｇｕｓｓａｒｂａ，ＡＡＴ４８９９３）Ｎａ＋一Ｋ＋－ＡＴＰａｓｅａ氨基酸序列有８７％相同，与欧洲鳗鲡（Ａｎｇｕｉｌｌａａｎｇｕｉｌ肠，ＣＡＡ５３７１４）Ｎａ＋一Ｋ＋－ＡＴＰａｓｅａ氨基酸序列有８６％相同，与斑马鱼（Ｄａｎｉｏｒｅｒｉｏ，ＡＡＧ２７０６０）Ｎａ＋一Ｋ＋．ＡＴＰａｓｅａ氨基酸序列有８５％相同，与虹鳟鱼（Ｏｎｃｏｒｈｙｎｃｈｕｓｍｙｋｉｓｓ，ＡＡＱ８２７８８）Ｎａ＋一Ｋ＋－ＡＴＰａｓｅａ氨基酸序列有８３％相同（如图３—５１。笙三兰茎里錾堕量堡型坌堑！！９１舡Ｎ四嗨虻正Ｋｎ蝉∞∞口日口ｗ口啪瞄舶蚯¨眦¨嫣阳∞嘣Ｉ叮ｈ惦编＾６ｕｈ瞒ｃｉ％帖ｈ伍ｃＩｃＫｈＩＳＬＣ矸Ｒ矗ＶＦＬＡＥＤＫＶＰＩＡ：二上二二：堡：』：：二：蔓二‘二Ｌ＝１Ｐ．卜１ｆ７．卜１ｉ７．Ｉ．，１『７．．Ｉ．．１产ｑＬＫＲＤ卜．．ｔ７７．弓目Ｉ．?ｆｏＳＥＶＡ＾＿Ｌ墨：：Ｌ二墨二：二Ｌ二：．２卜．Ｉ…２卜卜．２卜ｏ…２卜．ｆ２卜㈠．．２艮卜２ｆｏ１８１优Ｍ呼碍征玎峰日Ⅱ舡∞艄口铀旺珥ｗ融ｌｃＫ亿¨Ⅸ旺矗ｔ＾６砬“¨打疵Ｉ＾惦打Ｉ伍虹蜘赫时虻ｋ时＾矗ＬＬＫＣＩＥＬＴＣＧＳＶＮ＾ＦＲＥＫＹＰＫ工ＡＥＩＰＦＨ。：Ｌｊ：Ｉ：一：Ｌ：』生＝！＝：甲…卜３ｆｏ２７１哩口优世瞳“删到瓯：Ⅱ兀“皿亡｜阻崛Ⅲ＝ＩｃＧ＾印匝垴岫吐¨Ｄｄ＾优曲ｃｌ＿盯±％ｒ＾－Ｋ址ｋ醯曲面ｊ醅赫ｉ砖ＳＴ搏Ｋ！ｑＬＳＩＨＫＫＳＴｒＥＥＴＫＨＬＬＶ瓶Ｋ６Ａ卜ｊ严．．卜．５产．卜．吖？…卜３ｆｏｏ：ｆｏＥＲＰｊ一二二：墨Ｌ：翌：二二Ｌ墨…Ｉ，＿．？？Ｉ…甲…Ｉ．■卜？严卜ｍ卜甲３６１＾ＴⅡ∞蹬弱口伍ｍ嘲捌沉盯Ｉｃｍ曲∞强“辐帕孙∞ｃＩｃｔ瞄ｎＢ＾瞄陆舡６＾ｉ惦帕葩ｒｒｒ虻描＾赫面矗｝ＩＬＢＲＣＳＴＩＶＬｑ∈ＫＥｑｒＬ∞ＤＥ耕ＫＤ＾Ｆ瑶科盎ＹＶ４５１畸田喁９∞正皿畸惦惦崎峋１ｃⅡ％ｎ虻螅瞄ｎｍ崛ｍ∞味蛐６疵惦ｒｒ加∞商赧抽ｎ砣而哦ｉｉ砣▲ＥＬ０暑Ｌ§ＶＥＲＬ０ＦＣＨＹＮＬＰＤＤ；：上二二：曼＿二二：墨二：Ｌ卫二二二【．：乳Ｉｎ１．Ｉ０５卜卜乳卜叩Ｖ６｝＾ＦＰ亨ＤＡ６３１０嘎＝＾刖ｄａ＝．６刚旧Ｄ芘Ｔ∞０ＫＣＲＳ＾卜６ｆ？Ｉ甲图３－３青鲻鱼（ｏ，），２缸ｓｌａｔｉｐｅｓ）Ｎａ＋－Ｋ＋－ＡＴＰａｓｅａ基因的部分ｍＲＮＡ序列和相应氨基酸序列．Ｆｉ孚３－４Ｐａｒｔｉａｌｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅａｎｄｐｒｏｔｅｉｎｓｅｑｕｅｎｃｅｏｆｔｈｅｍｅｄａｋａ（Ｏｒｙｚｉａｓｌａｔｉｐｅｓ）Ｎａ＋－Ｋ＋－ＡＴＰａｓｅａｍＲＮＡ．４ＺＯ４３０Ｆｌｍｄ咀ＥＦＤａｎｉＤ抛ｆｉｏ（ｚｅｂｚａ：鼬ｈ）ａ瑚ｚ咖ｃｈ科目掣■喧村ＨｏｍｏＯｒｙｚ．ｘａｊｒｌａｒ．ｉｐｅ雪ｈｅｔｅｚｏｃｌｉｔ口４（ｔ１１１３９３３９ｑ３９３３９３３９８４０Ｉ１肋曲如Ｆａｒｇ鼬Ｆｍａｆ跏埘Ｆｓ啦ｅｗ伪ｍａＪＯ坷ｃｂｏｌａｇｕｓｃ叫旺ｃｕＩｌｚ－ｆｎ岫Ｃｘａｌｚｍｏ４６０４７０●８０４９０５００胁ｄＨｌ口ｓｈｏＬｅａ：ｏｃｌｉｔ岫舭１１ｑｑ３Ｄａ吐ｉｏ托．ｒｉｏ（ｚｅｂｍａ士＿ｉ＿ｓｈ）４４４ｓａ丑，ａｆ印ａｚ疆Ｆｑ４３肪曲ｄｏｇａ捌ｇｄ珂ｃｔ０１ａｇ氇，ｃ啦ｃＨｌＨＦ丑嘲ｓａ啦ｅｎｇ‘ｈ埘％曲Ｊｆｎｈｂ４４３Ｏ虹ｃｏｚｈ＿ｖｎｃｈｍｒ日掣童ｉ船肛ａＪ．ｎｂｏ４４８４５ｉ５０呻ｚｕ￥ｌａｔｉ】，ｅｓ