第二章实验材料和方法Ｎａ＋一Ｋ＋．ＡＴＰａｓｃａ熔解曲线ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎＣＵＩＶｅＳｏｆＮａ’．Ｋ＋．ＡｌＳＯ，ｓｅａ辞Ｓ锹鲻强ｆ掣弑囊融．０茂ｊｋ湍席Ｃ。？）Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ图ｏ－２青鲻鱼ＮａＹ．Ｋ＋－ＡＴＰａｓｅａ基因实时定量ＰＣＲ．ＳＹＢＲＧｒｅｅｎ荧光染料法熔解曲线图．Ｆｉｇ．２—２Ｈｅａｔｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎｃｕｉ、／ｅｓｆｏｒｍｅｄａｋａｇｅｎｅｓ，ｂｙＳＹＢＲ＠Ｇｔｅｅｎｄｅｔｅｃｔｉｏｎ．Ｔｈｅｗａｓｍａｒｋｅｄｏｎｔｈｅｇｒａｐｈｏｆｉｔ．ｈａ／ｈｅｏｆｅａｃｈｇｅｎｅ熔解曲线ｔ．ｉＲ—Ｊ＿一，Ｎ；—‘＋…ｔ’一Ｋ’．册ａ；ｅＢ～－‘。｛『ｕ●——Ｉ—ｌ囊穆棼％《ｂ萄Ｈ一；℃—＿——ｒ——－１＾＿——————蠢，辘√哥鞋图．一陋…——＿＿＾＿＿＿——ｉ尉…｛ｍｅｄａｋａ，ｂｙＳＹＢＲ＠图０－３青鲻鱼Ｎａ＋－Ｋ＋－ＡＴＰａｓｅｇ、ＧＲ和ＧＡＰＤＨ基因实时定量ＰＣＲ．ＳＹＢＲＧｒｅｅｎ荧光染料法熔解曲线Ｆｉｇ．２－３ＨｅａｔｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎｃｕｒｖｅｓｆｏｒＮａ＋－Ｋ＋－ＡＴＰａｓｅＢ、ＧＲａｎｄＧＡＰＤＨｇｅｎｅｓｏｆＧｒｅｅｎｄｅｔｅｃｔｉｏｎ．Ｔｈｅｎａｍｅｏｆｅａｃｈｇｅｎｅｗａｓｍａｒｋｅｄｏｎｔｈｅｇｒａｐｈｏｆｉｔ．２．４统计分析本研究采用ＳＰＳＳ１１．０统计软件进行各种检验和数据比较。采用独立样品Ｔ检验进行数据显著差异分析。－当ｐ＜Ｏ．０５时，认为差异显著。所有数据和图表均以平均值±标准偏差方式表示。第三章基因克隆与序列分析第三章基因克隆与序列分析３．１引言近年来，广盐性硬骨鱼类渗透压调节的分子机制己成为鱼类生理学的重要研究内容。广盐性硬骨鱼盐度适应过程中，血液皮质醇、生长激素水平增加，刺激鳃上氯细胞内Ｎａ＋．Ｋ＋－ＡＴＰａｓｅｍＲＮＡ的表达，提高酶的活性”“”１，酶活性的增加与氯细胞数量的增加以及鳃Ｎａ＋外排量成正比ｏ“。所以Ｎａ＋．Ｋ＋．ＡＴＰａｓｅ在鱼类渗透压调节过程中起重要作用。Ｎａ＋．．Ｋ＋－Ａｎ，ａｓｅ是硬骨鱼类渗透压调节组织中离子交换的关键性酶，它的基本结构是由～个ａ亚基（相对分子质量为１１０ｋＤ）和一个Ｂ亚基（相对分子质量为５５ｋＤ）组成“…，在哺乳动物中已经证实ａ和８亚基由不同基因编码，这两个亚基联合调控钠钾泵。Ｎａ＋．Ｋ＋．ＡＴＰＲｓＣａ亚基分子量较大含有功能酶的酶触反应结构域，在硬骨鱼类（海鲷、虹鳟、底鳊、斑马鱼等）上已经克隆了编码此亚基的基因“＋４“。Ｎａ＋．Ｋ＋－ＡＴＰａｓｅ６亚基分子量较小，其作用目前不清楚，但现有的研究表明，它是维持钠钾泵稳定性及正确膜定位的必要组成部分，编码Ｎａ＋一Ｋ＋－ＡＴＰａｓｅｇ亚基的基因在硬骨鱼类（海鲷、斑马鱼、欧洲鳗鲡等）上也得到了克隆“８～。研究表明，皮质醇是广盐性鱼类适应海水环境的调节激素。在海水适应过程中血液皮质醇水平会增加。皮质醇的各种生物学功能都是由特异性胞内糖皮质醇受体（Ｇｌｕｃｏ．ｃｏｒｔｉｃｏｉｄｒｅｃｅｐｔｏｒ，ＧＲ）介导的，ＧＲ是一种配基依赖型转录因子，属于类固醇激素受体超家族的一员，几乎存在于所有有核细胞中５“。由于鳃中有皮质醇受体，皮质醇可直接作用于鳃。皮质醇在体内和在体外都可刺激鳃Ｎａ＋．Ｋ＋一ＡＴＰＢ．ｓｃｍＲＮＡ的表达，提高酶活性，它还可以促进不成熟氯细胞分化为成熟氯细胞“’。并且皮质醇具有的控制糖代谢和免疫抑制等功能皆是通过ＧＲ来完成的“’“１。所以ＧＲ基因的克隆对研究皮质醇的分子作用机制有重要作用。青鲻鱼（Ｏｒｙｚ／ａｓｌａｔｉｐｅｓ，ｍｅｄａｋａ）是一种与斑马鱼齐名的模式试验鱼，日本及欧荚等国学者以青蝣鱼为材料，在遗传、发育、基因组、人类疾病模型、毒理学、航天生物学等多方面研究取得了重大进展。２００１年，Ｔａｔｓｕｙａ等报道了青鲻鱼可以作为研究渗透压调节机制的模式鱼９１，所以克隆青鲻鱼鳃内Ｎａ＋Ｋｉ＋－ＡＴＰａｓｅａ、Ｎａ＋一Ｋ＋ＡＴＰａｓｅ８和ＧＰ－＿基因，具有重要意义。本文通过现代生物信息学方法设计兼并引物，利用分子生物学技术对青蝣鱼Ｎａ＋一Ｋ＋ＡＴＰａｓｅａ、Ｎａ＋一Ｋ＋一ＡＴＰａｓｅｌ３和ＧＲ基因进行了克隆测序和分析。３．２青鲔鱼鳃内Ｎａ＋－Ｋ＋－ＡＴＰａｓｅａ基因克隆和序列分析兼并引物的设计通过对Ｇｅｎｂａｎｋ（ｂ！！Ｐ；￡＆型型：ｎ也ｉ：ｎ！啦：Ｂ瓿ｇＱ如中已知的其它生物Ｎａ＋．．Ｋ＋－ＡＴＰａｓｅａ１４青鳞鱼鲤内№ｏＫ＋－ＡＴＰａｓｅ基因的克隆及皮质醇对其表达的影响基因序列的搜索和比对，寻找保守序列，在此基础上设计兼并引物（表３—１）。Ｇｅｎｂａｎｋ中搜索到人（ＢＣ０９４８０１）、海鲷（ＡＹ５５３２０５）、兔子（ＡＦ２３５０２４）、虹鳟（ＡＹ３１９３９０）、底鲻（ＡＹ０５７０７２）及斑马鱼（ＡＹ００８３７５）等生物的Ｎａ＋．Ｋ＋－ＡＴＰａｓｅａ完整基因序列。运行ＣｌｕｓｔａｌＷＭｕｌｔｉｐｌｅＡｌｉｇｎｍｅｎｔ进行进行序列比对（图３－１）。通过比对选取保守区域设计兼并引物，设计参考以下几点：（１）引物长度２０ｂｐ左右：（２）引物中Ｇ＋Ｃ含量通常为４０％一６０％；（３）四种碱基应随机分布，在３端不存在连续３个Ｇ或Ｃ：（４）引物３’端与目的序列阅读框架中密码子第一或第二位核苷酸对应，以减少由于密码子摆动产生的不配对；（５）防止或减少发夹结构：（６）防止或减少出现引物二聚体：（７）引物不与模板结合位点以外的序列互补；（８）简并程度高时，更多依靠亲缘关系近的物种的密码子，例如如果人和斑马鱼有差别，可适当偏重依据斑马鱼。图３－１为本研究所用到的已知Ｎａ＋一Ｋ＋一ＡＴＰａｓｅａ蛋白氨基酸序列比对。ｆ删ｎｌｎ，＾ｅ￡ｅｆｏｃｎ矗ⅡＪＣｋ．ｔｌｌＤｍ吐．ｏｉｅ上ｉｏ（ｚｅｂｚａｆＸ．ｔｈｌ础ａｂｌ阳，ａｒｇｎｇ■ａ五ｂａｆ印ａｉｉｚ８丑Ⅲ∞??ｔｐｉｅｚＩＦｆｈｑｎ曲Ｊｏ珂ｒｃ￡以ｄｇｚｌ，ｃ啦ｃ口ｉｎ，ｆｉａｈｐｏ口ｃｏｚ琏，ｎｃｈｎｏ日啦ｉｊ０‘Ｉａｉ日撕Ｆ衄∞埘ｎ，＾ｅＺｅｌｏｃｌｉ扭疆“－ｎ１Ｄ皿ｉｏＺｅＺＩ。Ｏ（ｚｅｂｚａｆ：ｉｓｈｌ碰ｌ曲ｄｏ，ｄ１９田ｇｇａｚｂａｆＳ鼋ａｆｕ’ｏ玎ｃ￡０２ｄｇＨＦｃ皿吐ｃｎｌＨ＃ｆｊａｈｂｏ∞∞ｚｈｙｌｌｃｈ￡嗤ａ，＇ＪｋＪｕｒＢｆｎｉｎｂｏ且Ⅲ∞?‘叼｜ｉｅｚｔｊｆｈＨｍ曲，黼兰一ｆ叫Ⅱ１珏■ｈｅ￡ｅ删王ｉ扫ｌ，恤卫１１鼍ｈａｂａｏＩｄｚ§Ｉｕ｜｜ａｍｏｚ】ｒｃｔ０１ｄｇＨＦＢ，ｒａｔｉｏｚｅｚｉｏｔｚｅｂｘｎ－ｒ－－ｉ｜ｈ）ｔ翮ａ￡Ｈ｜ｆｊａｉｎｂｏ（船∞ｚｈ，ｎｃｈｎ？日簟量ｉｊ疆丑∞啦，ａ砖衄，ｐ比盹曲＇ｃⅡ４ｉｃｍｌ坤ｆｊａ岫ＦＥＥＩＩ曲】ｎＦｈｅ￡ｅｚｏ，ｒｃｌｉｔｎ，“注】１ＤａｎｉＤ．ｒｅ．ｄｏＩｚｅｂｚａ芏ｉｓｈ）Ｊ搬?曲ｄｏ－ｄ墨ｇｔ晴－ｍｄｔ却ａｒｌ珥ｆＪａｉｎｂ口ｏｒ】圮ｔ０１ａｇ日，ｃ硪ｉｃｍ删ｔＪ＇ｏｂｂ（搬∞ｚｈｙｚＩｃｈｎｓａ啦ｉＦＦＩ，！０１■ｏＦａｐｉ明，ｆｈＨＲ衄，第三章基因克隆与序列分析１５ＦｕｒｔｄｕｌＨＦＤ妞口ｚｅｌ－Ｊ－Ｏｆｚｅｂｎ｜互ｓ知Ｊ助ａＭｏｓａｒｇｌｚＦｆｓ阳ＪⅡｊＯｚｙｃ￡ｏｌａｇ≈喧ｃ毗ｃ以ｚｌＦｆｎ岫Ｏｈｃ．ｏＪｒｈｙｎｃｈｕｍ∞职ｈＦＦｆＪａｉｎｂｏ丑啪ｓａｐｉｅａ，ｆｈ８ｍ曲’ＦａｚｂａＦ缸Ｂｄ‘【王ｎＦｈｅＺｅｆｏｃｌｉ￡Ｈｇ“亡ｉ１１３１３３ｌｑ３１３３１３３１８３２１Ｄｄｌｚｌｌｉｏ朋矗ｏｆｚｅｂ姐￡蛐Ｊ肺ａｂｄｏＦ正目７ｌｌｌＦａｚｊｈａｆｓ却嘘ｊｔｌ，ｈｅｔｅｚｏｃｌｉｔ‘晖ｆ．ｔ．ｔｚｌ３９３３９ｑ３９３３９３３９８Ｏ巧ｃｔｏｌａｑ酣ｃＨｎｉｃｎｌ￡埘（ｚａｂｂ№∞ｓａｐｉｅａＨ伪∞，ＯｎＣｏｚｈｌｒ丑ｃｈｕｓＦｕｎｄｕｌｎＦＲ吐ｉ－｜ｔｚａ址ｏ∞ｉｈｅＺｅｚｏｃｌｉｔⅡＦ值ｉ１１ｑ７３ｑｌｑｑ７３ｑ７３ｑ７８ｑ８１Ｄａ皿口ｚｅｒｏｔｚｅｂｚａ￡ｉ啦，屁ｈ棚口，ａｆｇｌｌ，ｔａｚ蚰ｆ６ｐａｚｔｗｆｊｍｓａｐｉｅｍｓ伪ｍ∞，Ｆｕ丑ｄｕｌｕｓ０１－ｙ＇ｃＺｏｌａｇｕｌ删ｃｕｌｕｚ（ｚａｂｂ‘抽ｃｏｚｈ坤曲ｎＦ月啦ｉ■富（ｒ础ｒｍｏｈｅ￡ｅ删１ｉｔⅡ‘ｔｉｌｌ５５２５５ｑ５５２５５２Ｓ５７５５９Ｄａｒ垃。朋ｄｏ（ｚｅｂｚａｆｉ柚，孙ａｂｄｏｇａｚｇｕｔａｚｂａｔｓ口ａｚ瑚Ｏ丑ｊｃ￡ｏｌａｇｕｓｓｃⅡｎｉｃｕＩⅡｊ（ｚａｂｂ面商矗ｉ壶ｊｉ釜面ｉ‰ｉ；缸：面矗瞄逝豳溢ｊ盎５７０Ｓ８０Ｓ９０６００６ｌＯ（琉ｃｏｚｈ弹ｃｈｎｇ丑ｍ０冒ｆｚａｉｌｌｂｏＨｎ舶Ｆ１日ｐｉｅｎ，ａ硅瞳曲Ｊ胁如２ＨｓｈｅｔｅｒｏｃｌｉｔＨＦｆｔｉｌｌ６３２６，３４６３２６３２６３７６３８Ｄａ！ｔｉ口ｆｅｚ２０ｔｚｅ五ｒａ￡ｉ柚４鼬ａｂｄｏ？ａｆｇ￡ＨｓａｚｂａｆｓｐｉｎｌｊＤｒｙｃ￡０１?＆扣０ｃ皿ｉｃＨｌｌ搿ｆｎｈｂ０ｎｃｏ曲ｙＨ曲ｎＰ月，ｔｉ■，ｆｆａｉｚ出ｏＨＤｌ２Ｄ，?印ｉｅａＦｆｈ口蛐’ｎｍｄⅡ１口，ｈｃ￡ｅｆＤｃｌｉ￡ｎＦｆｋ．ｔｚｌ７１ｚ々ｉ４’１２７１２＇１７々１８ＤａｆＬｉ４聆ｒｉｏｆｚ曲ｚａ￡Ｌ０ｈ，胁ａｂｄｏｇａＪ口ｚ坤ｓｅ嘣ｂａｆｓｐａｒｕＦｏｚ弘￡０１Ｉｉｇ眦ＦｃⅢ吐ｃｕｌｔｚＦ（ｚａｂｂｏ珊爿＇Ｊ盘，ｚ曲￡擅日口嚏ｉＦＦｆｆｉｉＪ帅丑ｂＩｉＤ，?ｌｐ正ｅ丑ｔ‘矗Ⅱ啦ＪＦ出∞由２ⅡＦＩ）ｏｚ￡ｔｏｋ￡ｅ删ｉｉ￡Ｅｇｆｔｉ２１７９ｚ々９４７９２７９２７９７１９８ＫｅＫｌ。Ｏ（ｚｅｂｚａＺｉＩｈＪ嗣ｈａ：ｂｄｏＦａｆｇⅡ，ｓａｚ由ａＯｒＦｃｋｏｌａｇｕｓｆｓｐａ珊ｆｚ丑ｉＪＩｈｏ‘蕊ｃⅪ五啪ｃ血＆ｔ＾§嘘ｊｊｊＨｏＩ∞Ｆａｐｉｅｎ口ｃⅢ垃ｃＨｌｔＩｔ（ｚａｂｂ伍咖ａＪ