第二章实验材料和方法ｇ．测试ＲＮＡ质量：取１０ｐｌＲＮＡ溶液稀释至１ｍｌ，紫外测光吸收Ａ２６０、Ａ２８０，当Ａ２６０／Ａ２８０＞１．８时，表明所提总ＲＮＡ较好。取１０叫总ＲＮＡ溶液用０．８％甲醛变性凝胶电泳检测是否存在降解。其余ＲＮＡ可置于一７０。Ｃ长期保存。２．３．２组织样品总ＲＮＡ的ＤＮａｓｅＩ酶处理及纯化为了防止基因组ＤＮＡ的污染，取２０－５０，ｕｇ总ＲＮＡ进行无ＲＮＡ酶活性的ＤＮａｓｅＩ处理。无ＲＮＡ酶活性的ＤＮａｓｅＩ试剂购自宝生物公司（大连）。ＤＮａｓｅＩ处理步骤如下：ＤＮａｓｅＩ降解基因组ＤＮＡ：在无ＲＮＡ酶和ＤＮＡ酶的２００“ｌ薄壁离心管中加入下ｒａｉｎ。列试剂后３７℃温浴３０成分无ＲＮＡ酶的ＤＮＡ酶Ｉ（ＲＮａｓｅｆｒｅｅＤＮａｓｅ加样量１）１０ＵＲｉｃｏｍｂｉｎａｎｔＲＮａｓｉｎ＠Ｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（４０Ｕ／掣１）０．５／ａｌ１０×ＤＮａｓｅｌｂｕｆｆｅｒ５，ｕｌ总ＲＮＡ无ＲＮＡ酶的去离子水２０－５０ＦｇＪＪｌＪ至５０，ｕｌＲＮＡ的再纯化：在酶解反应物中加入５０／ＡＤＥＰＣ水；加入苯酚／氯仿／异戊醇（２５／２４／１），充分混匀：离心，取上层水相，加入１０芦ｌ的３ＭＮａＯＡＣ（ＰＨ５．２）；加入２５０川冷的无水乙醇，一２０℃放置３０分钟：离心，弃去上清，７０％酒精（ＤＥＰＣ处理）清洗；干燥后，溶解于５０肛ｌＤＥＰＣ处理水中。。２．３．３反转录反应（ｃＤＮＡ第一链的合成）本文共使用过以下二种逆转录酶，均有较好的效果。Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司反转录酶（ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔｌＩ和ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔｌＩＩ）Ｉ．ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＴＭＩＩ反转录酶的使用方法将反应液按下表配制并加入到无ＲＮＡ酶和ＤＮＡ酶的２００“ｌ薄壁离心管中，７０。Ｃ温浴１０ｍｉｎ，取出短暂振荡后，迅速置于冰浴中放置１ｍｉｎ以上。成分ｄＮＴＰＭｉｘｔｕｒｅ。１０ｍＭＲｉｃｏｍｂｉｎａｎｔＲＮａｓｉｎ＠ＲｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅＩｎｈｉｂｉｔｏｒ加样量１／ｄ０．１儿ｌ０．２Ⅳｇ１，ｕｌ（０．０２－０．４／．ｔｇ）Ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）１６Ｐｒｉｍｅｒ或Ｒａｎｄｏｍ总ＲＮＡＤＥＰＣ水Ｐｒｉｍｅｒ加至１２“ｌ在上述管中加入下列试剂：成分０．１ＭＤＴＴＲｉｃｏｍｂｉｕａｎｔＲＮａｓｉｎ＠ＲｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅＩｎｈｉｂｉｔｏｒ（４０Ｕｍｌ）加样量２“ｌｌ讲８青鳞鱼鳃内Ｎａ＋一Ｋ＋－ＡＴＰａｓｅ基因的克隆及皮质醇对其表达的影响５ｘｆｉｒｓｔ。ｓｔｒａｎｄＢｕｆｆｅｒ４“ｌ！！￡！！！堕￡！！！反转录反应条件：２５℃，１０ｒａｉｎ；４２９Ｃ，３０！些！！！塑型！ｍｉｎ；然后７０＂Ｃ，１５ｍｉｎ；最后转入４℃放置。用无ＤＮＡ酶蒸馏水将２０ｍ反转录反应液稀释到１００ｍ。ｔｉ．ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＴＭｌＩＩ反转录酶的使用方法将反应液按下表加入到无ＲＮＡ酶和ＤＮＡ酶的２００Ｈｌ薄壁离心管中，７０＂Ｃ温浴１０ｍｉｎ，取出短暂振荡后，迅速置于冰浴中放置１ｒａｉｎ以上。成分ｄ卜ｒｒＰＭｉｘｔｕｒｅ，１０加样量ｒｎＭＰｒｉｍｅｒ１“ｌ０．１“ｌ０．２ｐｇ１ｐｌ（０．０２－０．４“２）ＲｉｃｏｍｂｉｎａｎｔＲＮａｓｉｎ＠ＲｉｂｏｎｎｃｌｅａｓｅＩｎｈｉｂｉｔｏｒＯｌｉｇ００１）２０Ｐｒｉｍｅｒ或Ｒａｎｄｏｍ总ＲＮＡＤＥＰＣ水加至１３“ｌ在上述管中加入下列试剂：成分０．１ＭＤＴＴＲｉｃｏｍｂｉｎａｎｔＲＮａｓｉｎ＠ＲｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅＩｎｈｉｂｉｔｏｒ（４０Ｕ／＃１）５ｘ加样量１ｐｌ１ｐｌ４“Ｉｆｉｒｓｔ－ｓｔｒａｎｄＢｕｆｆｅｒＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ１１１１Ⅱｌ（２００Ｕ）反转录反应条件：２５。Ｃ，５ｍｉｎ；５０４Ｃ，３０．６０ｍｉｎ；然后７０℃，１５ｍｉｎ；最后转入４℃放置。用无ＤＮＡ酶蒸馏水将２０Ⅳｌ反转录反应液稀释到１００ｐｌ。２．３．４普通ＰＣＲ反应普通ＰＣＲ和半定量ＰＣＲ的引物设计一般采用ＰｒｉｍｅｒＢｉｏｓｏｆｉＰｒｅｍｉｅｒ５．０软件（ＰＲＥＭＩＥＲＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ），同时结合ＰｒｉｍｅｒＥｘｐｒｅｓｓ２．０（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，ｕｓ舢来选择稳定的引物。所用到的引物在大连宝生物、上海生工公司合成。ＰＣＲ试剂主要购自大连宝生物公司的５‰ｑＰＣＲ试剂盒。５０∥ｌＰＣＲ扩增系统试剂。如下表添加：成分ｅＤＮＡ第一链合成反应产物ＤＮＴＰｓＭｉｘｔｕｒｅ．１０ｍＭ５０＃１加样量ＭｇＣｌ２，２５ｍＭ１０×ＰＣＲＢｕｆｆｅｒ正义引物反义引物ＴａｑＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅＮｕｃｌｅａｓｅ—ＦｒｅｅＷａｔｅｒⅢ叫～例～～一第二章实验材料和方法９２．３．５实时定量ＲＴ．ＰＣＲ方法２．３．５．１引物设计一般实时定量ＲＴ－ＰＣＲ采用软件ＰｒｉｍｅｒＥｘｐｒｅｓｓ（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，ｕｓＡ）设计引物。但是对于一些复杂的基因需要结合生物信息学技术来设计。扩增条件一般为预变性９５＊Ｃ，１ｍｉｎ；２５．３５个循环：９５℃１５ｓ，５０．６０℃３０．６０７２０Ｃ２－８ｓ；ｍｉｎ延伸。循环次数主要根据基因表达量来确定，退火温度根据设计的引物来确定，退火时间和延伸时间根据扩增长度来确定。表２－１青酷鱼基因实时定量ＰＣＲ引物．Ｔａｂ．２－ｉＰｒｉｍｅｒｐａｉｒｓｏｆＳＹＳＲｏＧｒｅｅｎＲｅａＩ－ｔｉｍｅＰＣＲＡｓｓａｙｆｏｒｍｅｄａｋａ标准曲线各个基因的标准品是来源于普通ＰＣＲ产物，这些产物经过纯化后，测定ＯＤ２６０，然后按照公式（２—１）计算标准品基因拷贝数：唧船伽扣——１面厂—卫（２－１）对于ＤＮＡ而言，Ｃ＝５ｘｌＯ。５∥ｍｌ，ｘ１０２…；。。，ｍ，６．０２３ｘ１０２３×Ｃ×０Ｄ２６０ＭＷｔ指ＰＣＲ产物的分子量＝碱基对数×６．５８ｇｌ删。将制备的标准品从高浓度向低浓度依次稀释制备标准曲线，标准曲线浓度范围根据样品中目标ｍＲＮＡ的丰度确定，一般；荏１０４．１０１２拷贝Ｍ范围内能够很好的区分。图２—１是青鲻鱼Ｎａ＋．Ｋ＋－ＡＴＰａｓｅａ基因的标准曲线图，纵坐标是标准品稀释的梯度浓度的对数值（ＬｏｇＣｏ），横坐标是ｃｔ值（ＣｙｃｌｅＴｈｒｅｓｈｏｌｄＶａｌｕｅ，指反应管中荧光亮度达到一定的阈值时所需要的循环数），相关系数Ｒ２＞０．９９７。其余基因的标准曲线如下：Ｎａ＋－Ｋ＋－ＡＴＰａｓｅｆｉ：ＧＲ：Ｙ＝．０．２１６５ｘ＋１０．３５６（Ｒ２＝０．９９７６）Ｙ＝．０．２８７５ｘ＋１０．２７７（Ｒ２＝０．９９９１）Ｙ＝．０．２６６５ｘ＋１２．３６９（Ｒ２＝０．９９８４）。ＧＡＰＤＨ（内参基因）：竺———————ｊ翌幽堕塑二二！二二！！丝！！茎里笪壅堕星鏖堕壁墅茎鲞竺塑星堕Ｎａ＋－Ｋ＋－ＡＴＰａｓｅａ标准曲线ＳｔａｎｄａｒｄＣＯｌ－ｄｅＳｏｆＮａ＋．Ｋ’．ＡＴＰａｓｅ８§８７６５４３趔赣靛纂耳龄２ｌ０３０１０２０３０ｃｔ值ＣｙｃｌｅＴｈｒｅｓｈｏｌｄ图０－１青锵鱼Ｎａ＋＿Ｋ＋－ＡＴＰａｓｅａｅＤＮＡ实时定量ＰＣＲ标准曲线．Ｆ逸－２－１ＳｔａｎｄａｒｄｓｃｕｒｖｅｏｆｍｅｄａｋａＮａ＋－Ｋ＋－ＡＴＰａｓｅａｅＤＮＡｂｙｒｅａｌ—ｔｉｍｅＰＣＲ．２．３．５．２实时定量ＰＣＲ荧光染料法ＰＣＲ反应液配制核心试剂为ＳＹＢＲ＠ＧｒｅｅｎＰＣＲＭａｓｔｅｒＭｉｘ（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，美国），该试剂中含有ＰＣＲ缓冲液、ＭｇＣｌ２、ｄＮＴＰ、荧光染料（ＳＹＢＲ＠ＧｒｅｅｎＩ）、ＵＮＧ酶（ｕｒａｃｉｌＮ９一Ｇｌｙｃｏｓｙｌａｓｅ）、金牌Ｔａｑ酶（ＡｍｐｌｉｔａｑＧｏｌｄｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）。ＰＣＲ反应液配制：定量ＰｃＲ所用光学９６孔ＰｃＲ板（ＭｉｃｒｏＡｍｐ＠Ｏｐｔｉｃａｌ９６一ＷｅｌｌＲｅａｃｔｉｏｎＰＩａｔｅｓ）和光学透明塑料盖膜（０ｐｔｉｃａｌＡｄｈｅｓｉｖｅＣｏｖｅｒｓ）等耗材均购自美国应用生物系统公司（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）。ＦＣＲ反应条件５０＂Ｃ２ｒａｉｎ，激活ｕＮＧ酶活性；９５６Ｃ１０ｍｉｎ，灭活ｕＮＧ酶活性并同时激活金牌Ｔａｑ酶活性；４０个循环：９５。Ｃ１５ｓ，６０。Ｃ６０ｓ。在最后一个循环结束后做熔解曲线，验ｉ正ＰＣＲ反应质量。熔解曲线分析良好的ＰｃＲ反应熔解曲线呈现单～峰，而在二聚体、错配或非特异扩增出现时，熔解曲线会出现两个峰甚至多个峰（图２．２，２．３）。目前本研究已经建立青鲔鱼Ｎａ＋一Ｋ＋ＡＴＰａｓｅａ、Ｎａ＋－Ｋ＋一ＡＴＰａｓｅＢ、ＧＲ、ＧＡＰＤＨ基因的实时定量ＰＣＲ—ＳＹＢＲＧｒｅｅｎ荧光染料方法。