Ｉｖ青鳝鱼鳃内Ｎａ＋一Ｋ＋咱ＴＰａｓｅ基园的克隆及皮质醇对其表达的影响Ａｆｔｅｒｅｘｐｏｓｕｒｅｆｏｒ１２ｈｏｕｒｓ．１ｅｖｅｌｏｆＮａ＋－Ｋ＋－ＡＴＰａｓｅａｍＲＮＡｄｅｃｒｅａｓｅｄａｎｄｔｈｅｎｒｅｓｔｏｒｅｄｔｏｎｏｒｍａｌｌｅｖｅｌｓｏｖｅｒｔｏｔｈｅｌｏｗｅｓｔｖａｌｌｅｙｔｉｍｅ，ｈａｖｉｎｇａｔｅｎｄｅｎｃｙｏｆＵｓｈａｐｅ．Ｃｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈｔｈｅｓａｌｉｎｅｇｒｏｕｐ．ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｌｅｖｅｌｓｏｆＮａ＋一Ｋ＋一ＡＴＰａｓｅＢｖａｒｙｉｎｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ．ＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎｌｅｖｅｌｓｏｆＧＲｇｅｎｅｄｅｃｒｅａｓｅｄｓｈａｒｐｌｙ，ｂｕｔｗｉｔｈｔｈｅｅｘｔｅｎｓｉｏｎｏｆｅｘｐｏｓｕｒｅｔｉｍｅ，ｉｔｓｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｌｅｖｅｌｓｉｎｃｒｅａｓｅｄｇｒａｄｕａｌｌｙ．Ｔｈｅｓｅｒｅｓｕｌｔｓｗｉｌｌｐｒｏｖｉｄｅｉｍｐｏｒｔａｎｔｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓｆｏｒｅｌｕｃｉｄａｔｉｎｇｍｏｌｅｃｕｌａｒｍｅｃｈａｎｉｓｍｓｏｆｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｏｆｓａｔｕｒａｔｉｏｎｐｒｅｓｓｕｒｅｉｎｆｉｓｈ．Ｔｈｉｓｓｔｕｄｙｗａｓｔｏｄｅｓｉｇｎｅｄａｓｆｏｌｌｏｗｓ：ｍｅｄａｋｓｈａｖｉｎｇａｃｃｌｉｍａｔｅｄｔｏｓａｌｉｎｅｗａｔｅｒｏｆ１５；ｇ几ｗｅｒｅｔｒａｎｓｆｅｒｒｅｄｆｒｅｓｈｗａｔｅｒｓｃｏｎｔａｉｎｉｎｇｄｉｆｆｅｒｅｎｔｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓｏｆｈｙｄｒｏｃｏｒｔｉｓｏｎｅ（Ｏ．０１，０．１，１，１０，１００／Ｍｇ／Ｌ），Ｏ．ｍｇ／Ｌａｆｔｅｒｅｘｐｏｓｕｒｅｆｏｒ４８ｈｏｕｒｓ，ＩｔｉｓｄｉｓｃｏｖｅｒｅｄｔｈａｔｃｏｒｔｉｓｏｌｗｈｉｃｈｃｏｎｔｅｎｔｉｓｈｉｇｈｅｒｔｈａｎｐｒｅｖｅｎｔｅｄｄｒｏｐｂａｃｋｏｆＮａ４－Ｋ＋ＡＴＰａｓｅＢａｓｅｄｏｎａａｎｄＧＲｍＲＮＡｌｅｖｅｌｓｉｎｔｈｅｇｉｌｌ．ｃａｎｔｈｉｓｒｅｓｅａｒｃｈｒｅｓｕｌｔａｎｄｐｒｅｖｉｏｕｓｓｔｕｄｙ，ｏｎｅｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎｂｅｍａｄｅｔｈａｔｆｒｅｓｈｗａｔｅｒｗｉｔｈｈｙｄｒｏｃｏｒｔｉｓｏｎｅｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｓｅａ．ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓｏｆ０．１?１００／Ｍｇ／Ｌｍｉｇｈｔｃｏｎｓｔｉｔｕｔｅｐｏｔｅｎｔｉａｌｄａｍａｇｅｆｏｒｎｏｒｍａｌｏｆｓａｔｕｒａｔｉｏｎｐｒｅｓｓｕｒｅｏｆｍｉｇｒａｎｔｆｉｓｈｄｕｒｉｎｇｔｈｅｐｒｏｃｅｓｓｏｆ．ｅｎｔｅｒｉｎｇｉｎｔｏｒｉｖｅｒｓｆｒｏｍＫＥＹＷＯＲＤＳ：Ｈｙｄｒｏｃｏｒｔｉｓｏｎｅ，Ｎａ＋一Ｋ＋一ＡＴＰａｓｅ，ＧｌｕｃｏｃｏｒｔｉｃｏｉｄＲｅｃｅｐｔｏｒ，Ｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，ＯｒｙｚｉａｓＬａｔｉｐｅｓ研究生学位论文的独创性声明本人声ｕ』Ｊ：所呈交的学历硕士学位论文是我个人在导师指导下独立进行的研究工作及取｛：｝的研究结果：论丈中的研究数据及结果是按学校“关于规范西北农诛抖技大学研究生学术道德的暂行规定＂获得的，如果违反此规定，一切后果与法律责任均由本人承担．尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外．论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究结果，也不包含其他人和自己本人已获得西北农林科技大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料．与我一同工作的同志对本研究所做６々任何贡献均已在论文的致谢中作了明确的说明并表示了谢意。研究生签名僚磷Ｊ时问：１诉∥月印日导师指导研究生学位论文的承诺本人承诺：我的学历硕士研究生——所呈交的学历硕士学位论文是在我指导下独立开展研究工作及取得的研究结果，属于我现岗职务工作的结果，并严格按照学校《关于规范西北农林科技大学研究生学术道德的暂行规定》而获得的研究结果．如果违反学校Ⅸ关于规范西北农林科技大学研究生学术道德的暂行规定》，我必须接受按学校有关规定的处罚处理并承担相应导师连带责任．导师签名住捅，，，时间：二彤多年多月／０Ｅｌ关于其他单位与人员对研究生学位论文使用授权的说明任何收存和保管本论文各种版本的单位和个人未经本论文作者的导师授权，不得有对本论文进行复制、修改、发行、出租、改编等侵犯著作权的行为，否则，按违背“中华人民共和国著作权法》有关规定处理并追究法律责任。经本论文作者的导师同意，授权西北农林科技大学可向主管上级有关单位送交论叉的纸质件和电子文档，允许论文被查阅和借阅，可以采用复印、缩印或扫描等夏制手段保存、汇编学位论文；否则，按违背“中华人民共和国著作权法》有关规救啊袖耋～法亨乞赫仔簪一碧ｔ扩一ｑ佑ｔ左聱－弋抑咏僻伸第一章前言第一章前言１．１鱼类渗透压调节机制的研究进展有关鱼类渗透压调节的研究主要集中于广盐性鱼类耐受盐度变化的能力及洄游鱼类由海洋入江河或由江河入海洋过程中渗透压调节的变化等方面。鱼类的渗透压调节机理一般如下：１、由淡水进入海水，鱼会丢失水分，而当通过肠道大量吸收水分的同时又会有许多盐分随之进入体内，此外，高渗环境中各种离子也会通过鳃和皮肤被动地扩散到体内。鱼体内过多的盐分会被鳃等渗透调节器官排出体外，从而达到水和离子的平衡。鳃上氯细胞对离子的排出起非常重要的作用，而氯细胞中主要靠Ｎａ＋一Ｋ＋一ＡＴＰ酶活性增加为排出ＮａＣｌ提供能量。许多研究表明，随着环境盐度的增加，伴随着Ｎａ＋－Ｋ＋一ＡＴＰ酶活性的增加，而Ｎａ＋一Ｋ＋一ＡＴＰ酶活性的变化是受皮质醇、生长激素等激素控制的“…。２、由海水进入淡水。随着盐度的降低进入体内的离子减少，与之相适应通过调节使氯细胞数量减少，体积缩小，Ｎａ＋．Ｋ＋－ＡＴＰ酶活性下降。当降低到一定盐度或生活于淡水中时会出现各种离子的净流失，为了从外界水体中吸收离子，故而Ｎａ＊－Ｋ＋一ＡＴＰ酶活性增加。这与某些激素有很大的关系，如催乳激素““。鱼类鳃离子转运过程是耗能的，而所需要能量来自以鳃Ｎａ＋一Ｋ＋一ＡＴＰ酶为代表的ＡＴＰ酶分解ＡＴＰ产生５１。鱼类鳃Ｎａ＋．Ｋ＋．ＡＴＰ酶可促进鳃上皮Ｎａ＋的外排和Ｋ＋的内流，通常海水鱼类比淡水鱼类的酶活性高６１。皮质醇是广盐性鱼类适应海水环境的调节激素。海水适应过程中血液皮质醇水平会增加。由于鳃中有其受体，皮质醇可直接作用于鳃。皮质醇在体内和在体外都可刺激Ｎａ＋－Ｋ＋－ＡＴＰ酶的活性，并促进不成熟氯细胞分化为成熟氯细胞，同时刺激鳃№＋一Ｋ＋．ＡＴ／＇酶基因的表达，提高酶活性。另外，在罗非鱼等广盐性硬骨鱼体内，皮质醇还可以刺激生长激素的释放”１，生长激素（ｃＨ’是垂体分泌的一种肽类激素，它在鱼类海水适应过程中也起重要作用，它能够刺激鳃氯细胞增殖分化，使氯细胞数量增加，体积变大：并且线粒体数量增加，微小管系统广泛发育，增力［ＩＮａ＋－Ｋ＋．ＡＴＰ酶活性。淡水适应过程中血液中皮质醇和生长激素含量降低，催乳素（ＰＲＬ）升高。催乳素是广盐性鱼适应淡水生活的一种调节激素。催乳素的作用是在淡水适应过程中，使氯细胞变小并抑制Ｎａ＋．Ｋ＋．ＡＴＰ酶的活性。目前对鱼类渗透压调节机制已深入到了分子水平，Ｊｕｒｉａａｎｆ２００３），Ｅｄｄｉｅ（２００５）等研究表明硬骨鱼鳃内Ｎａ＋．Ｋ＋．ＡＴＰａｓｅａ和Ｎａ＋一Ｋ＋一ＡＴＰａｓｅＢ基因表达同对渗透压调节起关键性作用的Ｎａ＋．Ｋ＋－ＡＴＰ酶活性密切相关““。Ｍａｒｓｈａｌｌ（２００５）等的研究结果表明，阻断底鳞（Ｆｕｎｄｕｌｕｓｈｅｔｅｒｏｃｌｉｔｕｓ）鳃内糖皮质激素受体（Ｇｌｕｃｏｃｏｒｔｉｃｏｉｄｒｅｃｅｐｔｏｒ，ＧＲ），其鳃内Ｎａ＋一Ｋ＋一ＡＴＰ酶活性降低。１。但关于盐度对Ｎａ＋一Ｋ＋一ＡＴＰａｓｅａ、Ｎａ＋．Ｋ＿一ＡＴＰａｓｅ１３和ＧＲ基因表达的系统性研究甚少。２青鳝鱼鳃内Ｎａ＋一Ｋ＋－ＡＴＰａｓｅ基因的克隆及皮质醇对其表达的影响青鳎鱼（Ｏｒｙｚｉａｓｌａｔｉｐｅｓ，ｍｅｄａｋａ）是一种淡水生型广盐性鱼类，并且能在海水中繁殖。２００１年，Ｔａｔｓｕｙａ等报道青鳊鱼可以作为研究渗透压调节机制的模式鱼。１，然而，青鳎鱼鳃内Ｎａ＋．Ｋ＋．ＡＴＰａｓｅａ、Ｎａ＋．Ｋ＿．ＡＴＰａｓｅＢ和ＧＲ基因，到目前为止尚未得到克隆。１．２皮质醇做为环境污染物的研究进展在过去的３０年间，环境中持久性有机污染物ｆＰＯＰｓ）受到了国际社会的广泛关注，２００１年在联合国环境计划署的斡旋下，首个关于ＰＯＰｓ的世界公约在斯德哥尔摩产生。目前，被纳入管理清单的重点污染物只是生产和使用的大量化学物质中非常有限的一部分，许多化学物质长期以来不断通过各种途径被排放到环境中，由于种种原因这类物质并没有受到应有的重视。因此，环境中许多没有被认知或没有被认识到的风险物质，已经成为环境科学的主要探索对象“““１。医药品和个人护理品成分（Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ＆ＰｅｒｓｏｎａｌＣａｒｅＰｒｏｄｕｃｔＩｎｇｒｅｄｉｅｎｔｓ，ＰＰＣＰｓ）是容易被忽视的化学物质中非常庞大的一类物质。ＰＰＣＰｓ主要包括激素／类似物、抗生素、血脂调节剂、解热镇痛抗炎药、抗抑郁剂等“２‘”’。此类物质的污染和农药污染存在很大的不同：农药污染是季节性的，但是ＰＰＣＰｓ的污染是长年的，因此即使这些物质不具有典型持久性有机物那样高的生物富集性和环境持久性，水环境中的生物也将终生暴露在这样的环境中。许多国家的化学品审查法中增加了化学物质对环境中动植物的影响评价，但是像ＰＰＰＣｓ这类化学物质基本上只受医药品管理法的管制，化学物质审查法中并不涉及此类物质，因此成为环境管理的空白地带。在众多的ＰＰＣＰｓ物质中，激素类似物由于干扰生物内分泌系统，作为环境内分泌干扰物质，从上世纪９０年代中期开始，已经成为环境科学研究的焦点，甚至被全社会广泛关注。然而目前为止，环境内分泌干扰物质的研究仍然局限于生殖内分泌干扰物质，即影响下丘脑一垂体．性腺轴的化学物质，特别主要是集中在环境雌激素和雄激素的研究上。”…。但是，环境中还存在大量的化学物质可以直接影响人类其它内分泌轴。如，下丘脑一垂体一肾上腺皮质轴“”。医学证明，在社会普遍流行的疾病中，约７５—９０％与该内分泌轴的异常相关，其中心血管疾病（如高血压、动脉粥样硬化、冠心病、心肌梗塞等）、糖尿病和一些心理性疾病都与下丘脑一垂体一肾上腺皮质轴的异常有直接关系““。因此，研究环境中存在的化学物质对下丘脑．垂体．肾上腺皮质轴的影响对维护人类健康有着巨大的意义。皮质醇是衡量下丘脑．垂体一肾上腺皮质轴正常机能的一项重要指标，它是由’肾上腺皮质分泌的一种糖皮质激素。在正常情况下，血液中皮质醇含量较低，遇到突发有害状况时，血液皮质醇会迅速增高，使动物处于应激状态，对有害环境迅速做出反应。人工合成皮质醇及其类似物（如强的松、丁酸氢化可的松等）作为临床药物广泛应用于抗炎、抗病毒、抗休克及抢救危机病人。但是，这类物质的副作用（如水电解质平衡失调、骨质疏松、免疫力下降、自身肾上腺萎缩、药源性皮质醇增多症、诱发溃疡病、促发精神