第六章水环境中皮质酵影响青鲋鱼鳃内№＋一Ｋ＋－ＡＴＰａｓｅａ、Ｂ和ＧＲ基因表达的研究３７±Ｏ．００００３７（１，ｕｇ／Ｌ）、０．０００２４９＿－＊－０．００００２２（１０ｍ／Ｌ）、０．０００２２１±０．００００３（１００，ｕｇ／Ｌ）。Ｎａ＋．Ｋ＋－ＡＴＰａｓｅＢ０．５ｏ．４０．３０．２０．１ｊＩｌｄ目，叮０ｓａｌｉｎｉｔｙＤＭＳＯ００１ｐｇ／Ｌ０１ｕｇ／Ｌ１ｌａｇ／Ｌ１０Ⅱｇ／Ｌ１００ｕｇ／Ｌ图６－２实时定量ＲＴ－ＰＣＲ，ＳＹＢＲＧｒｅｅｎ荧光染料法对对照组ｆ０．００５％ＤＭＳＯ）、暴露皮质醇（０．０１、Ｏ．１、１、１０、１００＃ｇ／Ｌ）各组青鲻鱼鳃内Ｎａ＋一Ｋ＋－ＡＴＰａｓｅＢ基因表达定量结果．ｍ＝６，ｍｅａｎ±ｓ．Ｄ．Ｐ＜０．０５）。Ｆｉｇ６－２Ｎａ＋一Ｋ＋－ＡＴＰａｓｅ１８ｇｅｎｅｓｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｎｇｉＨｏｆｍｅｄａｋａｉｎ（０．０１、０．１、１、１０、１００ｐｇ／Ｌ）ｅｘｐｏｓｅｄｇｒｏｕｐｓｂｙｒｅａｌ－ｔｉｍｅ！Ｓ．Ｄｒｃｏｎｔｒｏｌ（ｏ．００５％ＤＭＳＯ），ｈｙｃｏｒｔｉｓｏｌＰＣＲ，ＳＹＢＲＧｒｅｅｎｄｅｔｅｃｔｉｏｎ．∽＝６，ｍｅａｎＰ＜０．０５）．０．００１０．０００８０．０００６ｈｏ＾ｌｊｌ口目ｎｂ０．０００４０．０００２０ｓａｌｉｎｉｔｙＤＭＳＯ０．０１ｐｇ／Ｌ０，１”ｇ／Ｌｌ”ｇ／Ｌ１０ｐｇ／Ｌ１００ｐｇｌＬ图６－３实时定量ＲＴ－ＰＣＲ，ＳＹＢＲＧｒｅｅｎ荧光染料法对对照组（０．００５％ＤＭＳＯ）、暴露皮质醇（０．０１、Ｏ．１、１、１０、１００ａｇ／Ｌ）各组青鳓鱼鳃内ＧＲ基因表达定量结果．伽＝６，ｍｅａｎ！Ｓ－ｎ＋实验组与盐水组相比差异显著（ｐ＜０．０５））。Ｆｉｇ．６－２ＧＲｇｅｎｅｓｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｎｇｉｌｌｏｆｍｅｄａｋａｉｎ１０、１００＃ｇ／Ｌ）ｃｏｎｔｒｏｌ（０．００５％ＤＭＳＯ），ｈｙｃｏｒｔｉｓｏｌ（０．０１、０．１、１、ｅｘｐｏｓｅｄｇｒｏｕｐｓｂｙｒｅａｌ—ｔｉｍｅＰＣＲ，ＳＹＢＲＧｒｅｅｎｄｅｔｅｃｔｉｏｎ．伽＝６，ｍｅａｎ±Ｓ．Ｄ．＋Ｐ＜０．０５）．６．５讨论图６－１实验结果表明，当青鲻鱼适应千分之十五赫度后，转入含有０．Ｉ、Ｉ、１０、１０ｑ“∥Ｌ皮质醇的淡水中，鳃内Ｎａ＋．Ｋ＋．ＡＴＰａｓｅａｍＲＮＡ回落水平受阻（４８小时）。青鳝鱼鳃内Ｎａ’－Ｋ。ＡＴＰａｓｅ基因的克隆及皮质醇对其表达的影响Ｍａｄｓｅｎ（１９９５），Ｅｄｄｉｅ（２００５）等研究表明鳃内Ｎａ＋一Ｋ＋－ＡＴＰａｓｅ是调节鱼类渗透压关键性酶，并且Ｎａ＋．Ｋ＋－ＡＴＰａｓｅａｍＲＮＡ同Ｎａ＋一Ｋｑ－ＡＴＰａｓｅ活性成正相关”’”，所以当水环境中含有０．１ｐｇ／Ｌ以上的皮质醇，将影响青鲻鱼鳃内Ｎａ＋．Ｋ＋－ＡＴＰａｓｅａ基因表达的回落，从而具有影响其渗透压调节的潜在危害性。从图６—３可以看出，青鲻鱼鳃内ＧＲ基因表达在含有Ｏ．１ｐｇ／Ｌ以上皮质醇水中，也显著高于对照组。同Ｎａ＋．Ｋ＋－ＡＴＰａｓｅａ在０．ｍｇ／Ｌ以上皮质醇水中表达量显著高于对照组的结果相一直，但Ｎａ＋．Ｋ＋－ＡＴＰａｓｅＢ基因表达量却无显著性变化。２００５年，Ｅｄｄｉｅ等在对海鲷鳃离体培养暴露皮质醇（１０ｎｇ／ｍＬ）时的研究结果也表明，Ｎａ＋一Ｋ＋－ＡＴＰａｓｅ基因表达量显著升高，Ｎａ。－．Ｋ＋．ＡＴＰａｓｅＢ基因无显著性变化“１。本实验为什么将适应较高盐度青鳝鱼转入到含有不同浓度皮质醇的淡水中？主要原因如下：一、当青鲻鱼适应适千分之十五盐度后Ｎａ＋一Ｋ，一ＡＴＰａｓｅａ、ＧＲ基因表达量显著升高（图５－１，５－３），Ｎａ＋．Ｋ＋．ＡＴＰａｓｅＢ基因表达变化不显著（图５—２），然后将适应１５∥Ｌ盐水后的青鲻鱼转入到淡水中，发现其鳃内Ｎａ＋一Ｋ｜＋一ＡＴＰａｓｅａ、ＧＲ基因表达量，在转入后１２小时显著低于盐水暴露组，４８小时又基本恢复正常（图５－４，５．６）。二、洄游鱼类由海水到淡水的适应过程中，血浆内的皮质醇含量迅速降低，催乳素含量升高，来调节其适应淡水的渗透压９１。然而在此过程中，如果涸游鱼类体内皮质醇含量不降低，会不会影响渗透压的调节，目前未见报道。三、从水环境污染角度来看，海洋的污染程度要远远低于江河的污染程度。所以当涸游鱼类由海洋进入到江河的过程中，环境污染产生的环境应激，将会导致洄游鱼类体内皮质醇含量的升高。四、鱼类内分泌系统能够在较短的时间内调节其体内皮质醇含量到正常。练上所述，本研究采用了在短时间内（４８小时）在淡水中暴露皮质醇，用荧光定量ＰＣＲ检测其对基因表达的影响。目的是从分子水平探索水环境中皮质醇（环境应激）对鱼类渗透压调节的潜在危害性。从本研究结果可以推测，淡水中含有较高浓度的皮质醇（Ｏ．１Ⅳ∥Ｌ及以上浓度）或者环境胁迫导致的鱼体内皮质醇大量升高，将对洄游鱼类由海洋进入江河过程中渗透压的正常调节构成潜在危害。ａ６．６本章结论当青鳝鱼适应千分之十五盐度后，转入含有０．１、１、１０、ｌＯＯｐ叽皮质醇的淡水中，暴露４８小时，鳃内Ｎａ＋．Ｋ＋．ＡＴＰａｓｅａ、ＧＲｍＲＮＡ回落水平受阻，Ｎａ－ｋ表达无显著性变化。Ｋ＋－ＡＴＰａｓｅＢ基因第七章本文结论第七章本文结论本文将生物信息学和分子生物学技术结合，克隆得到青鳝鱼Ｎａ＋．Ｋ＋－ＡＴＰａｓｅ＋一Ｋ＋－ＡＴＰａｓｅａ、ＮａＢ和ＧＲ三个基因的序列片段，并经过分析得到证实。成功的建立了青鲻鱼Ｂ和ＧＲ基因表达的实时定量Ｒ１二ＰＣＲ测定方法。应用Ｂ、ＧＲ三个基因在青鲻鱼鳃、脑、眼睛、Ｎａ－ｌ－Ｋ＋－ＡＴＰａｓｅａ、Ｎａ＋一Ｋ＋－ＡＴＰａｓｅ此方法检测到Ｎａ＋．ｋ＋．ＡＴＰａｓｅａ、Ｎａ＋．Ｋ＋．ＡＴＰａｓｅ肠、肌肉、肝和脾内都表达。并且Ｎａ＋．Ｋ＋－ＡＴＰａｓｅａ在青鲻鱼的各组织内表达水平是鳃＞肠“肝＞脾＞肌肉＞眼睛＞脑（图４．１），Ｎａ＋一Ｋ＋－ＡＴＰａｓｅＢ基因在各组织中表达强弱顺序是肠＞脾＞鳃＞肌肉一肝＞眼睛＞脑（图４—２），ＧＲ基因表达量是鳃＞肠一肝＞脾＞肌肉＞眼睛，脑（图４．３）。本结果为研究鱼类渗透压调节、免疫抑制、神经细胞兴奋的分子机制等提供基础数据。本文研究结果表明，青鳟鱼暴露在１５９／Ｌ的盐水中，适应盐度后，鳃内Ｎａ＋一Ｋ＋－ＡＴＰａｓｅａ、ＧＲｍＲＮＡ水平显著升高（ｐ（０．０５），Ｎａ＋一Ｋ＋－ＡＴＰａｓｅＢ基因表达无显著性变化。当成体青蝣鱼适应千分之十五盐度后，转移到淡水中，在不同时间段检测其鳃内Ｎａ＋一Ｋ＋．ＡＴＰａｓｅａ、Ｎａ＋一Ｋ＋－ＡＴＰａｓｅＢ和ＧＲ基因表达的变化，图５．４表明，鳃内Ｎａ＋一Ｋ＋．ＡＴＰａｓｅａｍＲＮＡ水平，随时间变化成“Ｕ”型趋势，即１２ｄ，时降到低谷，而后随时间的增长逐渐恢复正常。Ｎａ＋．Ｋ＋－ＡＴＰａｓｅＢ基因的表达水平和盐水组相比变化不显著（图５．５）《从图５．６可看出，青鲻鱼转入淡水后鳃内ＧＲ基因表达水平急剧降低，但随时间的延长，．ＧＲ基因表达水平逐渐增加。此结果对阐明鱼类渗透压调节的分子机制有重要作用。当青鲻鱼适应千分之十五盐度后，转入含有０．１、１、１０、１０叽ｇ／Ｌ皮质醇的淡水中，暴露４８小时，鳃内Ｎａ＋．Ｋ＿．ＡＴＰａｓｅａ、ＧＲｍＲＮＡ回落水平受阻，Ｎａ＋一Ｋ＿。ＡＴＰａｓｅＢ基因表达无显著性变化。根据实验结果，并参考前人研究成果，本文认为淡水中含Ｏ．１∥ｇ／Ｌ以上浓度皮质醇或者环境污染产生的环境胁迫，将对洄游鱼类由海洋进入江河过程中渗透压的正常调节构成潜在危害性。参考文献４１参考文献【１］ＨａｃｈｉｍＳｅｄｄｉｋｉ，ＧｉｌｔｅｓＢｏｅｎＬＢｅｎｇｔＦｉｎｓｔａｄ，ｅｔａ１．ＥｆｆｅｃｔｓｏｆｇｒｏｗｔｈｈｏｒｍｏｎｅｔｒｅａｔｍｅｎｔａｎｓｅａｏｎｏｘｙｇｅｎｃｏｎｓｕｍｐｔｉｏｎｗａｔｅｒａｄａｐｔａｂｉｌｉｔｙｉｎＡｔｌａｎｔｉｃｓａｌｍｏｎｐａｒｒａｎｄｐｒｅ—ｓｍｏｌｔｓ［Ｊ］．Ａｑｕａｃｕｌｔｕｒｅ，１９９６，１４８：４９－６２『２］ＭｃＣｏｒｍｉｃｋＳ．Ｄ．ＥｆｉｅｃｔｓｏｆＧｒｏｗｔｈＨｏｒｍｏｎｅａｎｄＩｎｓｕｌｉｎ—ｌｉｋｅＧｒｏｗｔｈｅＦａｃｔｏｒｌｗｉｔｈｏｎｓａｌｉｎｉｔｙｔｏｌｅｒａｎｃｅａｎｄａｎｄｇｉｌｌＮａ，Ｋ＋－ＡＴＰａｓｅｉｎＡｔｌａｎｔｉｃｓａｌｍｏｎ（Ｓａｌｍｏｓａｌａｒｙ）：ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｃｏｒｔｉｓｏｌ【Ｊ】ＧｅｎｅｒａｌＣｏｍｐａｒａｔｉｖｅＥｎｄｏｖｒｉｎｏｌｏｇｙ，１９９６，１０１：３－１１【３】３ＴｈｏｍａｓＤ．Ｓｉｎｇｅｒ，ＢｅｎｇｔＦｉｎｓｔａｄ，ＥｒｗｉｎＨ，ｅｔａ１．Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｖｅｅｆｆｅｃｔｓｏｆｃｏｒｔｉｓｏｌｔｒｅａｔｍｅｎｔａｎｄｓａｌｍｏｎｓｍｏｌｔｓ【Ｊ】．Ａｑｕａｃｕｌｔｕｒｅ，２００３，２２２：１５－２８【４］ＭｉｃｈａｅｌＣ．Ｊ．，ＰｈｉｌｉｐＡ，Ｖｅｉｌｌｅｔｔｅ．ＰｓｅｕｄｏｂｒａｎｃｈａｎｄｇｉｌｌＮａ＋，Ｃ－ＡＴＰａｓｅａｃｔｉｖｉｔｙｉｎｊｕｖｅｎｉｌｅＣｈｉｎｏｏｋｓａｌｍｏｎ，Ｏｎｃｏｒｈｙｎｃｈｕｓｔｓｈａｗｙｔｓｃｈａ：ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌｃｈａｎｇｅｓａｎｄｅｆｆｅｃｔｓｏｆｇｒｏｗｔｈｈｏｒｍｏｎｅ，ｃｏｒｔｉｓｏｌａｎｄｓｅａｗａｔｅｒｔｒａｎｓｆｅｒ【Ｊ】．ＣｏｍｐａｒａｔｉｖｅＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙａｎｄＰｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，２００３，１３５Ａ：２４９－６２【５】魏渲辉，汝少国，徐路等．海水和淡水适应过程中广盐性鱼类鳃氯细胞的形态与功能变化及其激素调节ｆＪｌ．科学视野，２００１，２５（４）：１６－２０【６］ＪｕｒｉａａｎＲ．Ｍｅｔｚ，ＥｒｗｉｎｃｏｍｍｏｎＨ．ｖａｎｄｅｎＢｕｒｇ，ＳｊｏｅｒｄＥ，ｅｔａ１．ＲｅｇｕｌａｔｉｏｎｏｆｂｒａｎｃｈｉａｌＮａ＋／Ｋ＋－ＡＴＰａｓｅｉｎｃａｒｐ（ＣｙｐｒｉｎｕｓｃａｒｐｉｏＬ１ａｃｃｌｉｍａｔｅｄｔｏｄｉｆｆｅｒｅｎｔｔｅｍｐｅｒａ—ｔｕｒｅｓ【Ｊ】．Ｔｈｅ【７］ＥｄｄｉｅＪｏｕｒｎａｌｏｆＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌＢｉｏｌｏｇｙ，２００３，２０６：２２７３－２２８０Ｅ．Ｄｅａｎｅ，ＮｏｒｍａｎＹ．Ｓ．Ｗｏｏ．ＣｌｏｎｉｎｇａｎｄｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆｓｅａｂｒｅａｍＮａ４．Ｋ＋．ＡＴＰａｓｅａａｎｄＢｓｕｂｕｎｉｔｇｅｎｅｓ：Ｉｎｖｉｔｒｏｅｆｆｅｃｔｓｏｆｈｏｒｍｏｎｅｓｏｎｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌａｎｄｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ【Ｊ】．ＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌａｎｄＢｉｏｐｈｙｓｉｃａｌＲｅｓｅａｒｃｈＣｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，２００５，３３１：１２２９－１２３８．【８１Ｗ．ＳＭａｒｓｈａｌｌ，Ｒ．Ｒ．ＦＣｏｚｚｉ，Ｒ．ＭＥｕｒｙｈａｌｉｎｅＰｅｌｉｓｅｔａ１．Ｃｏｒｔｉｓｏｌｒｅｃｅｐｔｏｒｂｌｏｃｋａｄｅａｎｄｓｅａｗａｌｅｒａｄａｐｔａｔｉｏｎｉｎｔｈｅｏｆｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｚｏｏｌｏｇｙ，２００５，３０３Ａ：１３２?１４２．ａｔｅｌｏｓｔ（Ｆｕｎｄｕｌｕｓｈｅｔｅｒｏｃｌｉｔｕｓ）【Ｊ】．ＪｏｕｒｎａｌＳ，Ｔｏｍｏｈｉｒｏ【９］ＴａｔｓｕｙａＫＡｋｉｙｏｓｈｉＴ，ｅｔａ１．Ｍｅｄａｋａ（Ｏｒｙｚｉａｓｌａｔｉｐｅｓ）ａｓｍｏｄｅｌｆｏｒｈｙｐｏｏｓｍｏｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｏｆｅｕｒｙｈａｌｉｎｅｆｉｓｈｅｓ【Ｊ】Ａｑｕａｃｕｌｔｕｒｅ，２００１，１９３：３４７－３５４，ｃｏｎｔａｍｉｎａｎｔｓ：ＥｍｅｒｇｉｎｇＲｅｓｅａｒｃｈ．ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｐａ．ｇｏｖ／【１０］ＤａｕｇｈｔｏｎＣＧＮｏｎ－ｒｅｇｕｌａｔｅｄｅｓｄ／ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ／ｐｐｃｐ／ｉｍａｇｅｓ／ｉｏｍ－２００３．ｐｄｆ【１１］ＵＳＥＰＡ２０００ＳｔｒａｔｅｇｉｃＰｌａｎ，ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｐａ．ｇｏｖ／ｏｃｆｏ／ｐｌａｎ／ｐｌａｎ．ｈｔｍｉｎｔｈｅｅｎｖｊｒｏｎｍｅｎｔ－ａｇｅｎｔｓｏｆ、ｆ二二ｓｕｂｔｌｅｃｈａｎｇｅＰｌ，ＥｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌＨｅａｌｔｈＰｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ，１９９９，１０７（６）：９０７—９３８，ＶＢｉｏｄｅｇｒａｄａｂｉｌｉｔｙｏｆｓｏｍｅａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ，ｅｌｉｍｉｎａｔｉｏｎｂａｃｔｅｒｉａｉｎａ【１３］ＫｕｍｍｅｆｅｒＫＡＩ—ＡｈｍａｄＡ，Ｍｅｒｓｃｈ—Ｓｕｎｄｅｒｍａｎｎｏｆ￡ｈｅｇｅｎｏｔｏｘｉｃｉｔｙａｎｄａｆｆｅｃｔｉｏｎｏｆｗａｓｔｅｗａｔｅｒｓｉｍｐｌｅｔｅｓｔｆＪ】．Ｃｈｅｍｏｓｐｈｅｒｅ，２０００，４０：７０１－７１０．【１４］Ｓｕｍｐｔｅｒ，ＪＥＸｅｎｏｅｎｄｏｃｒｉｎｅｄｉｓｒｕｐｔｅｒｓ?ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌｉｍｐａｃｔｓ【Ｊ】ＴｏｘｉｃｏｌｏｇｙＬｅｔｔｅｒｓ，１９９８，１０２?１０３：３３７－３４２．【１５］ＪｏｂｌｉｎｇＳ，ＴｙｌｅｒＣＲ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎｉｎｗｉｌｄｆｒｅｓｈｗａｔｅｒｆｉｓｈ【Ｊ】．ＰｕｒｅＡｐｐｌ．Ｃｈｅｍ．，２００３，７５（１ｌ一１２）：２２１９－２２３４．【１６ｌＧｏｍｅｓＲｋＳｃｒｉｍｓｈａｗＭＤ，ＬｅｓｔｅｒＪＮ．Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｏｆｅｎｄｏｃｒｉｎｅｄｉｓｒｕｐｔｅｒｓｉｎｓｅｗａｇｅｔｒｅａｔｍｅｎｔａｎｄｒｅｃｅｉｖｉｎｇｗａｔｅｒ［Ｊ］．Ｔｒａｃ－Ｔｒｅｎｄ．Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ，，２００３，２２（１０）：６９７－７０７．ｄｉｓｒｕｐｔｅｒｓｏｆｔｈｅｓｔｒｅｓｓａｘｉｓｉｎｎａｔｕｒａｌｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ：Ｈｏｗｃａｎ【１７］ＮｏｒｒｉｓＤＯ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅｗｅｔｅｌｌ？【Ｊ】