上述方法有

一个共同点，那就是任何一个小片段DNA分子的PCR扩增产物都是在空间上聚集的：原位polony法和桥式PCR法中所有的产物都集中 在平板的某处，在微乳液PCR法（emulsion PCR）中所有的产物都集中在微珠的表面。真正的测序反应本身和传统测序法一样，是由重复的聚合酶促反应和最后的荧光读取分析反应组成（图6）。本文讨论 的所有测序仪都是使用合成测序法（sequencing by synthesis），即通过聚合酶或连接酶不断地延伸引物获得模板序列，最后对每一轮反应的结果进行荧光图像采集、分析，获得序列结果。

1.1 454测序仪

454测序仪的出现极大促进了测序业务的开展，科研人员已经将测序技术作为解决科研工作中许多常见问题的利器。这是因为454测序仪在以下几个方面 取得了质的突破：首先是解决了高通量测序问题；其次它简化了样品准备步骤，将以往转化大肠杆菌扩增质粒的繁琐过程全部用简单的体外PCR扩增法替代了；最 后，它缩小了测序反应体积，节省了试剂。这样，454测序仪做到了以极其低廉的价格进行大规模平行测序反应。它的测序规模之大、测序费用之低是以往的测序 仪无法匹敌的。454测序仪与其它的新一代测序仪一起，降低了测序检测的费用，推动了测序技术平民化进程，使得小实验室也能开展测序检测项目，打破了以往 只有少数几个大型测序中心才能进行测序研究的“垄断地位”。在过去的18个月里，由于有了454测序仪的帮助，人们对人类基因组的结构有了更深入的了解， 同时第一次使用非Sanger测序法对个人进行了测序，还建立了一种发现小RNA的新方法。不过，要能让更多的人使用上新一代的测序产品，它们还需要变得 更便宜，并且更加容易操作。在一段时间之内，454测序仪必定会进一步降低测序费用，帮助人们迎接个人基因组时代的到来。

自从诺贝尔奖得主Frederick Sanger和Walter Gilbert（图2）分别发明了链终止法DNA测序技术（sequencing by chain termination technique）和链断裂法DNA测序技术（sequencing by chain fragmentation technique）之后，人们就一直希望能够扩大DNA测序技术的处理规模。到了今天，我们对测序技术的需求和对计算机技术的需求一起出现了迅猛的增 长，因为测序技术的发展速度已经远远跟不上实验要求的增长速度。于是出现了好几种替代Sanger测序法的新型测序方法，比如杂交测序法、借助原子力显微 镜（atomic force microscopy）直接DNA成像测序法（direct imaging of DNA sequence）、质谱分析法、合成测序法以及微液流测序法等等。在我们进行人类基因组计划时还出现了三项技术改进方法，即使用荧光标记物取代了放射性 标记物来标记终止碱基（双脱氧碱基）；使用毛细管电泳（capillary electrophoresis）取代了传统的平板凝胶电泳；建立了末端配对测序法（paired-end sequencing）来对质粒、fosmid、人工细菌染色体（BAC）等短片段序列进行测序，解决了测序长度带来的限制问题。同时，开展研究的自动化 液体分装技术（liquid-handling robotics）帮助我们摆脱了人工试管操作，可以用自动化的方式在微量滴定板（microtiter plate）上装载待测序样品（质粒等），极大地降低了测序的费用和劳动强度。

随着美国454 Life Sciences公司（该公司现已被美国罗氏公司收购）的第一台新一代测序仪——454测序仪的面世，我们获得了一种完全不同的测序方式。454测序仪引 领的新一代测序技术在一直困扰传统测序技术的三个瓶颈问题上取得了突破。这三个问题分别是文库制备、模板制备和测序。而且，在随后出现的其它新一代测序仪 产品身上，我们或多或少都会发现在454测序仪上使用到的技术，这也足以说明454测序仪的技术创新的确取得了巨大的成功。

454测序仪的先行者地位使它对整个测序业的影响远远超过了其它新一代测序仪竞争对手。这一点从Leamon、Rothberg等人撰写的一篇介绍 2005年技术进展的论文被引用了570多次的事实，以及有100多篇经过同行审议的关于人类遗传学、代谢组学、生态学、进化学以及古生物学的论文 （peer-reviewed publications）都是使用454测序仪开展的研究多个事实中都能够得到证明。454测序仪技术是继Sanger测序技术之后出现的第一个用于对 细菌基因组进行从头测序的新技术，也是第一个被用来对人类基因组进行测序的非Sanger测序技术。其它使用454测序仪开展的重要研究项目包括探究蜜蜂 消失原因的项目、研究人类基因组重排复杂性的项目、建立用于研究传染性疾病新方法的项目以及对尼安德特尔人（Neanderthal）基因组的测序项目等。

1.1.1 摩尔定律对454测序仪的影响

454测序仪的迅猛发展不是因为我们想要Sanger测序仪小型化，而是因为新型奔腾芯片的出现以及摩尔定律法则给我们带来的希望。很明显，常规的 人类基因测序项目会对我们处理测序技术的能力提出更高要求，这与我们对计算机处理能力的要求是一样的。不过，只有将计算机的电子管换成晶体管，才为后来集 成电路技术的发展提供了可能，这正是计算机产业发展的关键所在。而希望对传统的毛细管电泳技术进行改良，提高它的速度和处理规模，正如只用电子管直接制作 集成电路一样不可能。因此，如果将各种测序技术比作一个个晶体管，将一系列测序步骤整合起来比作集成电路，那么也就可以用摩尔定律来预测DNA测序技术的 发展速度了。

合成测序法概念虽然在提出的时候还不算成功，但它的出现为测序仪小型化奠定了基础。基于合成测序法出现了两种策略：一种是循环可切除终止测序法 （cyclic reversible termination technology），即依次逐个添加荧光标记的碱基，继而检测荧光信号，切除荧光基团，如此往复；另一种策略是焦磷酸测序法（sequenced by detecting pyrophosphate release）。454测序仪采用的正是焦磷酸测序法，因为它似乎比第一种方法的效率更高。结果证明，454公司的选择是正确的。454测序仪采用的是 小型化焦磷酸测序反应，测序模板准备和焦磷酸测序反应步骤都是在固态芯片上完成的。

实际上，早在上世纪90年代中期，焦磷酸测序技术就已经被科研界用来进行基因分型工作了，但那时的焦磷酸测序技术还不能够满足标准的测序实验要求， 因为它的测序长度太短，因此只能用于旨在发现SNP的基因分型研究当中。当时进行基因分型操作时，是在微量滴定板（microtiter plate）上进行的，可以连续

进行最多96次基因分型实验，平均每个样品花费20美分。那时焦磷酸测序还不能用于从头测序工作，因为从头测序需要对每一 个尤其是第一个碱基都能准确地区分清楚，而焦磷酸测序只能简单地对已知位点的碱基进行检测，而且从头测序要求的测序长度也是焦磷酸测序法无法达到的。

不过，由于焦磷酸测序的原理是通过检测碱基掺入时发出的光来进行测序的（图3），所以它并不需要类似于电泳之类的物理分离过程来对碱基进行区分。这 也就是说焦磷酸测序仪可以“缩小（减）”到只需要检测光线就够了，而不需要像传统的测序仪还需要电泳设备，而这正是限制传统电泳仪小型化的关键所在。发光 检测方法还能够进行多路平行操作，但是直到454测序仪出现之前，还没有人这样做过，以前都是依次进行检测的。和晶体管早期的遭遇一样（当时人们也怀疑晶 体管替代不了电子管），人们同时对高密度的，用于并行焦磷酸测序的反应也充满了疑问。不过，当我们不再在溶液中进行测序反应，而是将测序模板、所有的试剂 （酶）都固定在平板上制成芯片之后，就获得了小型化的，能进行多路并行处理的测序仪，这就与晶体管被小型化并整合成

集成电路的过程一样。此外，借 助微量滴定板上一个个的小孔所达到的将不同测序反应进行分隔这一目的，也能通过在单个固相支持物上进行严密包裹（隔离）的反应来实现。在这些各自隔绝的反 应体系中，链聚合反应速度和发光速度都能通过对反应试剂和产物弥散状况进行严密的控制来进行精密的调整。

1.1.2 新的并行试验方法

在开发新型高通量、高并行运行方法时碰到的一个关键问题是，如何将反应试剂同时加入数量如此之多的各个反应体系中？在焦磷酸测序的过程当中需要反复 加入不同的碱基以供测序反应使用，而当时的自动化加样设备无法有效地做到对这么多的反应体系同时循环加样。于是，开发一种全新的高密度并行处理方法这一重 要课题又再一次摆在了科研人员的面前。这一次，我们找到了一个非常简单但是又很巧妙地方法。在高密度的反应芯片表面使用层流（laminar flow）加样方式，反应试剂会通过扩散作用很好地进入每一个反应体系，而且也可以用层流的方式洗去多余的反应试剂。现在，所有的新一代测序仪都采用了这 种层流加样方法。

为了将每个单独的测序反应都分隔开来，我们一开始使用平板（芯片），不过在平板上平均每一平方厘米的面积上最多只能同时进行数百至数千个反应。但我 们希望达到的是在每平方厘米的面积上同时进行100万个测序反应，这样才能令测序仪小型化，同时节省试剂并进行快速成像和测序。为了实现更高密度的测序反 应，我们在平板上制作了很多小孔，将每个反应体系都安置在这些小孔中，这些小孔都足够深，足以分隔每个反应体系。虽然这种方法极大提高了测序反应的密度， 缩小了平板的面积，但是要达到我们的要求还是需要60mm×60mm大小的芯片才行。

针对图像采集问题使用了商业化的天文学照相（astrological grade camera）器材，在电荷偶合装置（CCD）的表面连接上光纤束（fiber-optic bundle）。这些光纤是锥形排列的，这样可以将大范围的光信号都传输到CCD表面上很小的一个范围。采取下面两个步骤，我们就可以制成含有高密度小孔 的芯片：先将光纤束连接到类似于载玻片一样的一次性芯片上，然后用酸蚀刻（acid etching procedure）技术在玻片的另一面打上小孔。这种酸蚀刻技术是根据制作生物传感器的技术改进而来的。

454公司制作的每张芯片上可以达到数百万个小孔，每一个小孔都是一个独立的“反应站”，互不干扰，测序反应发出的光被连接在芯片上的光纤传送到 CCD记录下来（图4）。这种芯片就好像集成电路一样一次可以同时处理数百万个测序反应。这种芯片同样也能被其它通过发光检测技术的产品所使用。454测 序仪也没有像以前的96孔板焦磷酸测序仪那样使用液态的试剂，而是将试剂和模板统统都吸附在一个个微珠上，然后把这些微珠一个个地放到芯片上的小孔中，每 孔一个微珠。这种固定步骤不仅保证了每孔测序反应的独立性，也极大地节省了试剂消耗费用。

要想实现高通量基因组测序，只对测序步骤进行优化还是远远不够的。人类基因组计划花费的30亿美元经费中有很大一部分都用在了测序样品制备阶段。当 时即使是采用最简单的制备样品方法也需要将目标片段克隆到细菌中，挑克隆，再转到96孔板，然后进行克隆扩增，提取质粒，制备测序模板。这种工作流程既耗 时也耗钱。

如果采用新型的文库制备方法就可以极大地节省这部分开支，这种新型的方法是先分离基因组DNA，随机切割成小片段分子，然后通过有限稀释 （limiting dilution）和聚合酶扩增反应，即体外克隆方式（clones without bacterial）制备模板片段。这样，从模板制备到最后的测序反应整个过程都能够在体外完成。

1.1.3 从发明到创新