1. 信号肽切割位点和目的基因核苷酸序列5’端的设计酶切位点问题

1.1 目的蛋白N端不要增加氨基酸：a-信号肽在kex2 和ste13处进行切割，

若要目的蛋白不增加额外氨基酸，则需要在kex2对应核苷酸序列前的XhoI作为酶切位点，并补齐信号肽切割所需的序列（酶切位点下游的信号肽对应的核苷酸序列）

1.2 目的蛋白N端可增加氨基酸。则可以选用其他的酶切稳点，保证下游不

出现移码突变就行了。（具体参考具体酶切位点切割点，及其上游核苷酸数有否保证刚好是3的倍数）。

2. 目的基因核苷酸序列3’端的设计酶切位点设计、终止密码子设计 2.1如果不希望有c-myc和His-tag，可以在基因片段末尾加入终止密码子；

3. 载体构建问题

3.1 pPICZ系列比较容易操作，大肠和毕赤酵母均用抗Zeocin筛选，对于大小

合适（30—50KD）的蛋白在产量上是pPIC9K无法比拟的

3.2 pPIC9K属于穿梭质粒，也可以在原核表。PIC9K操作麻烦一点，大肠用amp

抗性，而毕赤酵母先用His缺陷筛选阳性克隆，在利用G418筛选多拷贝）， 3.3位点不能出现在目的DNA片段中——如果片段长无法避免，可以采用平末端连接；

3.4虽然α-factor可以自动切除，但是在设计表达的时候，如果在N端不能出现任何多余的aa（比如药物蛋白表达），需要特别留意（说明书上有详细说明：P13）；

3.5有三种不同的读码框（对于pPICZα系列来说就是对上α-factor序列），在设计克隆的时候要反复确定自己的读码框是否正确，这可是致命的问题；

3.6无论pPICZ还是pPICZα都有TGA（终止密码子），但是pPICZ系列没有ATG

（起始密码子），有人认为酵母启动子与外源基因的ATG之间的距离越短对于表达的该基因越有利；

3.7如果不希望有c-myc和His-tag，可以在基因片段末尾加入终止密码子；

3.8 Pichia的密码子与酿酒酵母的相似，有关基因表达偏好密码子的问题有人认为没有必要更换，有人认为一定要换，个人认为以产量为主要目的的可以考虑更换基因密码子，而如果片段过长就比较麻烦，不过有许多真核保守蛋白其实是和酵母密码子相似的；

3.9克隆菌株需要有recA，endA，试剂盒带有的TOP10挺好用的（其它像是DH5α都行），但是要注意带有筛选抗生素Zeocin的培养基要用低盐培养基（NaCl减半），这主要是因为怕影响到抗生素作用（Zeocin平板要避光保存）；

3.10测序引物可以用α-factor信号引物，也可以用5'AOX1引物；

3.11如果需要高量表达，可以考虑做克隆的时候串联基因片段进行表达，另外也可以在转化酵母的时候重复转化。

3.12目的基因中最好不要含有pro-glu-ser-thr这样的序列，因为这个序列是激活蛋白水解酶的作用底物，会影响表达，另外也不要含有x-phe-x-arg-gln和gln-arg-x-phe-x这样的序列（x=任何氨基酸），因为这些序列容易受到容酶体的切割，而且目的蛋白末端最好是ala,asp,val,ser这样的氨基酸。除此之外许多高A+T含量的基因通常会由于提前终止而不能有效转录，也需要多加注意。

4. 毕赤酵母类型选择问题

4.1赤酵母类型其中X-33由于是野生型，因此耐受性比较好，如果担心转化率的话可以考虑这种酵母菌，而GS115与X33一样都是属于MUT＋表现型，也就是说可以在含甲醇的培养基中快速生长，但是据说会对外源基因表达有

影响，KM71是MUT-型酵母，在甲醇培养基中生长缓慢，但是也有利于翻译后加工，比如形成二硫键，糖基化等等，另外SMD1168则是基因组中的Pep4基因发生突变，造成蛋白水解酶活性的丧失，可以保护表达产物免受降解，促进表达量的提高。

4.2 表达形式与毕赤酵母选择胞内表达，应尽量用Mut－细胞，这样得到的蛋白产物中醇氧化酶蛋白量较少而目的蛋白量相对较多(约占Pp总分泌蛋白量的30-90%。而对于分泌蛋白的表达，无论是甲醇利用慢 (Mut-)还是甲醇利用快(Mut+)的细胞都可应用。一般手册都会建议同时在这几种菌株中进行转化，这主要是因为不同的基因在不同的酵母菌中可能表达量截然不同，因此在最开始的时候建议多用几种酵母菌实验。

4.3传代对转化率、表达量等影响原始酵母菌一定要保存好，传代多次后会影响其转化率和表达量，所以一方面分多管分装保存于-80℃，另一方面如果出现了转化或者表达的问题，在其它方面都没有出错的前提下可以考虑重新取出新菌液（每次都要涂平板挑菌）。

5. 转化质粒问题

5.1转化质粒要求由于酵母菌转化对转化质粒的要求较高，量也较大（5-10ug），要准备好足够量的质粒，并且不要忘记也要同时准备空载体以做对照。 5.2转化质粒提纯要求在线性化之后的质粒就可以进纯化回收。选择合适的纯化回收试剂盒，优化回收步骤，目的提高回收效率，获得更多的线性化质粒，同时减少回收质粒中的其他残留，例如残留的酒精对于转化的影响颇大。

5.3是否线性化问题在转化前质粒需要进行线性化，这主要是为了增加重组率（EasySelect试剂盒表达量高的一个重要原因也就在于其原理是将目的片段整合到载体上，大大的增加了目的片段的表达）。

5.4线性化位点问题线性化位点个人认为也会影响到表达量，对于基因片段不大的蛋白可以考虑用几个线性化位点同时进行转化筛选，但是如果片段大，就有可能供选择的机会少，而且也有可能遇上没有合适的线性化位点的情况，这个时候也不是说不能进行表达，但是准备的质粒就要增加10倍，另外也可以进行部分酶切（即先进行预实验，掐定时间和酶量保证被切开的质粒有部分是在线性化位点切开而基因片段保存完好）。

6. 电转化问题

6.1 转化酵母最好每次都从平板上挑酵母菌，用培养过的酵母放置时间不要超过一个星期；

6.2酵母生长状态按照电转化说明书的OD，尽量保证这个时候的酵母比较新鲜，转化率才比较高；

6.3冰上操作整个感受态制作过程中一定要在冰上操作，离心最好也用冷冻离心机，这是影响转化的关键。为了进一步保证这一点，无菌水可以是冰水混合物，另外山梨醇和电转杯都要预冷；

6.4电转仪需要预热准备感受态的时候就可以把电转仪打开了，电转后山梨醇的加入要快。这个过程要快，电转后可以看看时间，如果时间过短（比如<4ms）就可能说明杂质较多，会影响转化率；

6.5转化后温育目的是为了增加同源重组，增加存活率。需要注意不要感染了大肠杆菌，再加入培养基30℃摇一段时间，可以取部分涂板或者也有人将菌短暂离心，弃去上清，剩余全部涂板以保证转化率。

7. 挑选单克隆问题

7.1在protocol中用了许多篇幅来指导这一步，包括如何去通过平板筛选，观测生长速率来确定Mut表现型等。这个过程需要3到5天，而我一般只用用了4个小时进行PCR（AOX引物）筛选。