甘薯ADK基因反义表达载体构建

基 因 工 程

实 验 报 告

2009级生物科学（师范） 1 班 第 1

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组

甘薯ADK基因反义表达载体构建

甘薯ADK基因反义表达载体构建

（西南大学生命科学学院，重庆400715）

摘要：以甘薯为材料，提取甘薯的基因组DNA，以其基因组DNA为模板在体外克窿甘薯ADK基因核心片段并电泳检测基因的纯度。然后，将含有目的基因ADK基因的基因片段与T载体用限制酶BamHⅠ+XbaⅠ进行双酶切后连接，将带有目的基因的T载体导入大肠杆菌DH5?感受态细胞中，扩增之后，在加有相应抗生素的LB平板上筛选阳性克隆、筛选并PCR检测鉴定。最后，对表达载体进行酶切鉴定。

关键词：甘薯；腺苷酸激酶基因（adk）；反义载体；双酶切；PCR检测鉴定

英文摘要：For the materials with sweet patato extraction, the genomic DNA, with its genomic DNA gallery for template in vitro ADK genes, sweet core fragments and electrophoresis gene purity. Then, the purpose ADK genes with T carrier, with a purpose to connect the genes DH5a escherichia coli T ectors to feel normal cells, the expansion in the corresponding after plate screening of antibiotic LB positive cloning. At the same time, the extract of high quality sweet RNA in RNA, electrophoresis its purity.

Keywords: sweet potato; adenylate kinase gene (adk); antisense carrier; digestion; PCR detection and identification

1.综述

1.1甘薯

甘薯(Ipomoea batatas (L. ) Lam.)属旋花科(Convolvulaceae)甘薯属(Ipomoea)蔓生一年生草本植物，染色体数为2n=6x=90。在我国因各地语言差异，甘薯的中文俗名较多，又名番薯、白薯、地瓜、山芋、红芋、红苔、红薯等，其英文一般写作sweet potato，在美国也有写为sweetpotato。1989年美国甘薯合作者组织规定用Sweetpotato表示甘薯，以便更准确地表达甘薯的特性及与Potato(马铃薯)相区别。目前，此表达方式已在美国、澳大利亚等许多英语国家采用，并逐步被其他国家或地区的甘薯研究者所接受。目前学术界一致公认甘薯起源于热带美洲，经“Kumara\路线、\Batata\路线、\Kamote\路线传播到世界各地。由于甘薯具有耐旱、耐痔，繁殖力强、适应性广、栽培简便、产量高，用途广泛等特点，现已在全世界广泛栽培。我国的甘薯栽培己有400多年的历史。据史料记载，甘薯于16世纪的1563-1594年间，经陆海多种渠道传入我国。在我国，甘薯的栽

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培分布很广，南起海南诸岛，北至内蒙古，西北达陕西、陇南和新疆一带，东北经辽宁、吉林延展到黑龙江南部，西南抵藏南和云贵高原。四川盆地、黄淮海、长江流域和东南沿海各省是我国甘薯的主产区 1.2 ADK基因

腺昔酸激酶(EC.2.7.4.3, adenylate kinase, ADK)催化ATP和AMP合成两分子ADP的可逆反应，是调控这三种前体分子在淀粉代谢库和核酸代谢库中分配的关键酶。IbADK全长1314bp，其编码区长度为855bp，编码长度为284个氨基酸残基的ADK蛋白(IbADK)；生物信息学预测IbADK分子量为30.86kDa，等电点为6.46 1.3 反义载体

将目的基因与载体用相同限制性内切酶酶切后，将目的片段反向插入载体中，可以起到基因沉默的目了，构建过程主要是酶切，连接检测，最后测序确定。 1.4质粒（Plasmid）

是一种染色体外的稳定遗传因子，大小从1-200kb不等，为双链、闭环的DNA分子，并以超螺旋状态存在于宿主细胞中。质粒主要存在于细菌、放线菌和真菌细胞中，他具有自主复制和转录能力，能在子代细胞中保持恒定的拷贝数，并表达所携带的遗传信息。 1.5 转化(Transformation)

是将外源DNA分子引入受体细胞，使之获得新的遗传性状的一种手段，它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术。

2．材料与方法

2.1材料

2.1.1大肠杆菌 ：含PHB载体质粒的大肠杆菌；含PMD-T-aIbADK质粒的大肠杆菌；大肠杆菌DH5α菌株。 2.1.2仪器

PCR扩增仪，PCR用薄壁管，电泳仪，恒温水浴锅，THZ-C水平摇床1台，冷冻离心机1台，涡旋仪1台，超净工作台1台，移液枪 1套，锥形瓶若干，培养皿2套，室内使用的大中型枪头各2盒，浮标1个，室内使用的1.5mL的EP管若干，涂棒1根，凝胶成像系统1台，恒温培养箱1台，一次性PE手套，计时器1个，药勺若干。 2.1.3试剂

氨苄青霉素，AP/Amp：溶于无菌水，0.22μm滤膜过滤。 卡那霉素，km/Kan：溶于无菌水，0.22μm滤膜过滤。

TIANGEN质粒小提试剂盒（离心柱型）；BamHΙ、XbalΙ（Fermentas公司）；

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ddH2O；TIANGEN普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒（离心柱型）；DNAligation连接试剂盒；CaCl21瓶；常规PCR试剂1套；上游引物FaADK；下游引物RaADK；TBE缓冲液；回收级琼脂糖；溴化乙锭； Taq DNA聚合酶；10×PCR buffer；MgCl2；dNTP；marker（DL2000、λDNA/HindⅢ各1支）。 2.1.4培养基

LB液体培养基：蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 10g/L，pH7.0，灭菌后4℃保存。

LB琼脂平板（400ml、800ml）：蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 10g/L，琼脂15g/L，pH7.0，灭菌后冷至60℃左右铺平板，视具体需要加相应抗生素做成Amp（50mg/L）或Kan（50mg/L）等平板。 2.2方法

2.2.1 质粒DNA的提取、纯化、电泳检测及酶切

1.将含有PHB载体质粒的大肠杆菌和含有PMD-T-aIbADK质粒的大肠杆菌接种在加相应抗生素（Kan、Amp）的LB液体培养基中摇菌培养至合适浓度后，采用TIANGEN质粒小提试剂盒（离心柱型）抽提质粒（具体方法与步骤见试剂盒说明）。

2.抽提的质粒DNA用琼脂糖凝胶电泳检测、并拍照。

3.对提取的PHB载体质粒和PMD-T-aIbADK质粒进行BamHⅠ、XbalⅠ双酶切鉴定。37?C水浴过夜反应，结束后加入5μL的10×Loading Buffer停止反应，再进行琼脂糖凝胶电泳检测、照相。

2.2.2酶切片段的回收及与表达载体的连接反应

1.用TIANGEN普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒（离心柱型）对酶切后目的基因片段aIbADK（小片段）和pHB载体骨架(大片段)进行切胶回收（操作步骤见试剂盒说明）。

2.将回收的目的基因片段aIbADK和pHB载体骨架进行连接。16?C过夜。 2.2.3大肠杆菌感受态细胞的制备 用CaCl2法制备大肠杆菌DH5?感受态细胞 2.2.4重组质粒的转化、筛选及PCR检测鉴定

1.将制备好的感受态细胞与已纯化的质粒DNA及5-10μlDNA连接物混匀，冰上放置30min后，42?C水浴热激90sec，迅速取出立即放于冰上2min，室温再放置3-5min。

2.加入LB液体培养基培养至菌复苏，离心去800μl上清，剩余菌液每100μl涂布于加相应抗生素的LB固体培养基，7?C倒置培养。

3. 以挑取的单菌落菌液为模板，用反义引物：FaADK，RaADK进行PCR扩增目的基因。反应完成后，将PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳进行检测，并拍照。

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