大肠杆菌感受态细胞的制备及质粒DNA的转化

一、实验目的和要求

通过本实验学习氯化钙法制备大肠杆菌感受态细胞和外源质粒DNA转入受体菌细胞的技术。了解细胞转化的概念及其在分子生物学研究中的意义。 二、实验原理

感受态细胞(Competent cells):

受体细胞经过一些特殊方法（如：CaCl2，等化学试剂法）的处理后，细胞膜的通透性发生变化，成为能容许外源DNA的载体分子通过的感受态细胞(competent cell) 。

转化（transformation）：

是将异源DNA分子引入一细胞株系，使受体细胞获得新的遗传性状的一种手段，是基因工程等研究领域的基本实验技术。

进入细胞的DNA分子通过复制表达，才能实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。转化过程所用的受体细胞一般是限制－修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变株。

转化的方法：

化学的方法:使用化学试剂（如CaCl2）制备的感受态细胞，通过处理将载体DNA分子导入受体细胞；

电转化法：使用低盐缓冲液或水洗制备的感受态细胞，通过高压脉冲的作用将载体DNA分子导入受体细胞。

克隆的筛选：

主要用不同抗生素基因筛选。常用的抗生素有：氨苄青霉素、卡那霉素、氯霉素、四环素、链霉素等；

将经过转化后的细胞在选择性抗生素培养基中培养，才能较容易地筛选出转化体，即带有异源DNA分子的受体细胞。否则，如果将转化后的菌液涂在无选择性抗生素的培养基平板上，会出现成千上万的细菌菌落，将难以确认哪一个克隆含有转化的质粒。 三、操作步骤

1）大肠杆菌感受态细胞的制备(CaCl2法)

（1）从E.coli DH5α菌平板上挑取一单菌落，接种于3ml LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜。将该菌悬液以1:100～1:50转接于200ml LB液体培养基中，37℃振荡扩大培养，当培养液开始出现混浊后，每隔20～30min测一次OD600nm，至OD600nm≤0.5时停止培养（约2－3小时）；

（2）每人取1个离心管，转入1ml培养液，在冰上冷却2-3min，于4℃，5000rpm／min离心5min（从这一步开始，所有操作均在冰上进行，速度尽量快而稳）；

（3）吸干上清培养液，用0.5 ml冰冷的0.1 M CaCl2溶液轻轻悬浮细胞，，冰浴15 min ；

（4）5000rpm／min离心5min；

（6）弃去上清液，加入100μl冰冷的0.1 M CaCl2溶液，小心悬浮细胞，冰上放置超过1小时后，即制成了感受态细胞悬液；

（7）制备好的感受态细胞悬液可直接用于转化实验，也可加入占总体积15％－20％左右高压灭菌过的甘油，混匀后分装于1.5ml离心管中，置于-70℃条件下，可保存半年至一年。

2）细胞转化

(1) 取1 μl质粒DNA加入 100μl感受态细胞，轻轻混匀，冰上放置30min，

(2) 于42℃水浴中保温1min，然后迅速冰上冷却2min

(3) 立即向上述管中分别加入1ml LB液体培养基，摇匀后于37℃振荡培养约45-60min ，使受体菌恢复正常生长状态，并使转化体表达抗生素基因产物(Ampr)（该步骤可以省略）。

3) 平板培养

(1) 取各样品培养液20ul或50ul，涂布于含Amp抗菌素的LB平板培养基上，（用玻璃棒涂抹，酒精灯烧过后稍微凉一下再用，不要过烫）。 (2) 菌液完全被培养基吸收后，倒置培养皿，于37℃恒温培养箱内培养过夜(12-16小时)。

用 CaCl2法制备的感受态细胞，可使每微克超螺旋质粒 DNA产生

5?106-2?107个转化菌落。在实际工作中，每微克有105以上的转化菌落足以满足一般的克隆实验。 五、实验结果

实验中使用自制的质粒，结果成功，观察到如下图中所示的培养结果。转化成功的质粒DNA呈蓝色。

转化效率

（1）转化子总数＝菌落数×稀释倍数×转化反应原液总体积／涂板菌液体积

（2）感受态细胞总数＝受体菌对照组菌落数×稀释倍数×菌液总体积／涂板菌液体积

（3）转化频率（转化子数／每μg质粒DNA）＝转化子总数／质粒DNA加入量(μg)

（4）感受态细胞转化效率＝转化子总数／感受态细胞总数 六、实验讨论

1． 应设立对照：

2． 应注意涂板用菌液浓度：

一般应对菌液进行等比稀释，用不同稀释度菌液进行涂板（每一稀释度涂布

二皿），使生长出来的菌落互相独立、不混淆，便于挑取单菌落。

3． 防止杂菌和杂DNA的污染

（1）整个操作过程均应在无菌条件下进行

（2）所用器皿， 如离心管、 tip头等最好是新的，并经高压灭菌处理； （3）所有的试剂都要灭菌，且注意防止被其它试剂、DNA酶或杂DNA所污染， 否则会影响转化效率或杂DNA的转入， 为以后的筛选、鉴定带来麻烦。