细菌营养缺陷型菌株的诱变及筛选

摘要 营养缺陷型菌株在杂交育种、研究微生物代谢途径、遗传分析等方面具有重要应用意义。针对微生物诱变要得到的特定表型效应，具有不同的筛选方法。本次实验以紫外线作为诱变剂，诱发大肠杆菌的营养缺陷型突变，过程中用青霉素法浓缩缺陷型，基本培养基与完全培养基比对筛选，最后经生长谱法鉴定得到了一株亮氨酸缺陷性大肠杆菌菌株。 关键字 大肠杆菌，营养缺陷型，紫外诱变，筛选，生长谱鉴定

用某些物理因素或化学因素处理细胞，使其基因突变，丧失合成某一物质（如氨基酸、维生素、核苷酸等）的能力，这样从野生型经诱变筛选得到的菌株，称为营养缺陷型。在营养上表现某种缺陷的菌株，必须在培养基中加入某种有机营养成分后才能够正常生长。突变前的菌株称为野生型菌株，或称为原养型菌株。能够满足野生型生长的最低营养成分的合成培养基，叫做基本培养基。能够满足营养缺陷型菌株生长的培养基，叫做完全培养基。不同的微生物有不同的营养要求，因此基本培养基也各不相同。

营养缺陷型菌株，在生产实践中可作为杂交育种和发酵核苷酸、氨基酸等中间代谢产物的出发菌株或生产菌株，在遗传分析中也作为遗传分析的菌株。同时，也是研究微生物代谢途径的重要材料。

营养缺陷型的筛选一般具有以下几个环节：诱变处理，营养缺陷型的检出，划线复证，生长谱鉴定，缺陷型菌株纯化。又因处理的细菌所得到的突变菌仍然是很少的部分，因此必须采用有效的筛选方法，才能分离得到突变型。

本次实验用紫外线来诱发大肠杆菌基因突变，并用青霉素法淘汰野生型，最后经生长谱法鉴定细菌的营养缺陷型，掌握细菌营养缺陷型诱变及选育方法。

1. 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1实验器材

1ml、200μl枪尖各一盒、牙签一瓶、500ml锥形瓶、100ml锥形瓶、试管、7cm培养皿、9cm培养皿、量筒、移液枪、玻璃棒、紫外灯、黑布、恒温培养箱、离心机、涂布棒、电子天平、酒精灯、接种环等。 1.1.2实验材料 1.1.2.1 菌株 大肠杆菌E.coli K12。 1.1.2.2培养基 LB液体培养基：

酵母膏0.5g，蛋白胨1g，NaCl 0.5g，蒸馏水，100ml，pH7.2 。 2×LB液体培养基：

酵母膏0.5g，蛋白胨1g，NaCl 0.5g，蒸馏水50ml，pH7.2。 基本培养基： Vogel 50×(即浓缩50倍)：MgSO4·7H2O 10 g，柠檬酸100 g，NaNH4HPO4·4H2O 175g,

K2HPO4·2H2O 599.88 g (K2HPO4·3H2O 656.319 g),水600ml。

使药品溶解后再定容至1000ml。（配好后，放入冰箱保存备用）。 基本固体培养基：50× 2ml，葡萄糖2g，蒸馏水98ml，琼脂2g，PH7.0，110℃灭菌20min 无N基本液体培养基：

K2HPO4 0.7g；KH2PO4 0.3g; 柠檬酸钠· 3H2O 0.5g；MgSO4 ·7H2O 0.01g; 葡萄糖2g,蒸馏水100ml，pH7.0，110℃灭菌20min 2N基本培养基：

K2HPO4 0.7g；KH2PO4 0.3g; 柠檬酸钠·3H2O 0.5g；MgSO4·7H2O 0.01g; (NH4)2SO4 0.2g;葡萄糖2g；蒸馏水100ml，pH7.0，110℃灭菌20min 完全培养基：

同LB培养基，固体培养基加 2%琼脂。 混合氨基酸和混合维生素 1.2 实验方法 1.2.1诱变处理

第一天，接种：取一环E.coli于5mlLB液体三角瓶中，37℃培养过夜。 第二天，诱变：早上添加5mlLB液，继续培养4-6小时；取5ml菌液于离心管中，7000rpm离心3-4分钟，弃上清，加生理盐水5ml，洗涤一次，再加入生理盐水5ml打匀沉淀；吸取菌液3ml于小培养皿（7cm）内，将培养皿置于15W紫外灯下30cm处（处理前紫外灯预热30min），将培养皿连同盖一起置于15W紫外灯下灭菌1min，然后打开皿盖照射2min，照射后先盖上皿盖再关灯；吸3ml 2倍LB液加入处理过的菌液平皿内，混匀，用黑布（纸）包好，置37℃避光培养12h以上。

1.2.2营养缺陷型浓缩

第三天，延迟处理：吸菌液3ml于离心管中，7000rpm离心3-4min，弃上清。离心洗涤两次（加4ml生理盐水，打匀沉淀，离心，弃上清，重复一次），最后加生理盐水制成3ml菌悬液。取0.2ml菌液于5ml无N培养基中，37℃培养12h。（消耗体内的N素，使停止生长，避免缺陷型被以后加入的青霉素杀死） 第四天，初筛：按1:1比例加入2N基本培养液5ml，加入10μg/ml氨苄青霉素溶液20ul，使氨苄青霉素在溶液中的最终浓度约为20μg /ml，再放入37℃培养。（野生型利用氮大量生长，细胞壁不能完整合成而死亡。缺陷型因不生长避免被杀死）。

第五天，从培养12、16、24小时的菌液中分别取50μl菌液到基本及完全培养基两个培养皿中，涂布，37℃培养。 1.2.3营养缺陷型检出

第七天，检出营养缺陷型。上述平板培养约36h后，进行菌落计数。选取完全培养基上长的菌落数大大超过基本培养基的一组，用灭菌牙签挑取完全培养基上长出的菌落200个分别点种于基本培养基和完全培养基上（先基本，后完全），置37℃培养。

第九天，复证：选在基本培养基上不生长，完全培养基上生长的菌落在完全培养基和基本培养基上分别划线，先基本后完全，37℃培养24h。完全培养基上生长，基本培养基仍不长的菌株是营养缺陷型。 1.2.4营养缺陷型鉴定

第十天，生长谱的测定。取一环营养缺陷型菌落接种于10mlLB液体培养基中，置37℃过夜培养。

第十一天，取5ml菌液于5ml离心管中。7000rpm，离心3-4min，弃上清，加生理盐水，打匀沉淀，共离心洗涤3次。加5ml生理盐水制成菌悬液。取其1ml于培养皿中，基本培养基融化后冷却到40－50℃，倾注混匀，平放，共二皿。将皿底分成8格用接种环依次放

入少许混合氨基酸等，37℃培养24h，观察生长情况，确定是哪种氨基酸营养缺陷型。

2． 实验结果与分析

2.1 诱变处理结果

本次实验紫外诱变处理的时间为2分钟，在缺陷型浓缩一步中氨苄青霉素的终浓度处理为了10μg /ml，隔天又补加氨苄青霉素，使其最终浓度达20μg /ml，

这些因素使得浓缩后培养12、16、24小时的菌液的涂布结果均表现为完全培养基上菌落数远远多于基本培养基上菌落数。 2.2 缺陷型检出结果

完全培养基上点种的200格几乎全部有菌落生长，而在基本培养基上多个位置没有菌落生长，与完全培养基比对，发现基本培养基上标号为11、23、26、27、89、90的小格完全没有菌落生长，其对应的完全培养基上的菌落有可能为营养缺陷型。选取完全培养基上11、26、89、90号四个小格中的菌落进行划线复证。 2.3 复证结果

培养基划分为4个部分，基本培养基上四部分均无菌落生长，完全培养基上26号、90号菌株没有生长，原因可能是观察不仔细，对应的检出完全培养基上菌落也没有生长，即划线时没有挑到菌种。89号菌落呈乳白色，判断为感染的杂菌。11号表现为正常的大肠杆菌菌落，且分离得到了小而圆的单菌落，判断为营养缺陷型。 2.4 生长谱测定结果 下图为本组实验结果

图1 生长谱测定结果

在以本组11号菌株为实验菌株的3个倾注平板中，标号为4的区域均出现了一个颜色较深的生长斑，即菌株生长良好的区域。平板上只有标号为4的区域出现生长斑。

各区域氨基酸加入情况如下：

1 2 3

Lys His Ala

Arg Arg Met

Met Thr Thr

Cys Glu Hydro-pro

Purine Asp Gly

Cystine Pyrimidine Ser

4 5 6 7 8

Leu Phe Trp pro

Cys Cystine Purine

Glu Asp Pyrimidine

Hydro-pro Gly Ser

Ile Ile Val

Val Tyr Tyr

混合维生素（B1、B2、B6、泛酸、对氨基苯甲酸，烟碱酸及生物素等）

由上表可知，亮氨酸是4区中所独有的，故该菌株为一亮氨酸缺陷型菌株。

3. 总结

亮氨酸是在蛋白质最常出现的一种氨基酸，如果细胞不能利用亮氨酸，会很容易在细胞的生长特性上表现出来，所以亮氨酸缺陷型是比较容易检出和获得。

本次实验通过对大肠杆菌的诱变处理、营养缺陷型检出、划线复证、生长谱鉴定等的一系列操作，筛选出了大肠杆菌E.coli K12的亮氨酸缺陷型菌株，同时了解了细菌营养缺陷型诱变及选育方法

本次实验用紫外线来诱发大肠杆菌基因突变，并用青霉素法淘汰野生型，最后经生长谱法鉴定细菌的营养缺陷型，掌握细菌营养缺陷型选育原理，掌握了营养缺陷型诱变及筛选方法。 但是在实验中，对筛选出的营养缺陷型菌株没能够进行保存，导致生长谱测定后确定了的营养缺陷型的菌种丢失，这是本次实验的一大失误。进行细菌营养缺陷型菌株诱变及筛选的目的是获得营养缺陷型的菌株，而不仅仅是检测菌株的营养缺陷型，在今后的实验中还需明确实验目的，有目的有计划地进行实验。

4. 思考题

4.1 在实验中进行生长谱测定时，为什么采用倾注平板的方法？

倾注平板时先将菌液加入平皿中，再倒入培养基摇匀，这样比较能够使得菌体在整个平板中的分布比较均匀，使实验结果更加准确。而采用涂布的方法，很难保证菌液的均匀分布，同时容易在培养基表面留下水迹，造成氨基酸的溶解扩散，使实验失败。

4.2 在用氨苄青霉素浓缩缺陷型时，延长处理时间会对实验结果有何影响？ 氨苄青霉素能够抑制细菌细胞壁的形成，进而抑制细菌生长。诱变处理后的细菌经过一段中间培养，让其突变型充分表达，然后培养在含氨苄青霉素的基本培养基中，就可以淘汰（杀死）大部分野生型细胞而达到浓缩的目的。氨苄青霉素只能杀死生长繁殖的细菌，但不能杀死停止生长繁殖的细菌。延长氨苄青霉素处理时间，野生型细菌进入衰亡期后，氨苄青霉素不再发挥作用，因此，浓缩时延长氨苄青霉素处理时间是不必要的。

参考文献

微生物学研究技术.山东大学出版社.