第三军医大学硕士学位论文表６直接ＰＣＲ扩增体系（单位为ｕ１）配制完毕后，置．２０℃保存备用。２．建立的直接ＰＣＲ扩增体系的初步检验：以未经ＤＮＡ提取纯化的带有ｐＵＣｌ８质粒的ＤＨ５ｄ菌株的菌液为模板，采用所建立的直接ＰＣＲ扩增体系和Ｅ．ｃｏｌｉ（ＡＥ００５１７７）引物组，设置阴性对照，进行ＰＣＲ扩增。扩增完毕，行１．５％凝胶糖凝胶电泳检测扩增结果，结果以１０种所建立的直接ＰＣＲ扩增体系均能有效扩增目的核酸片段，如图所示（图８），阴性对照管不能有效扩增（结果未记录）。结果表明，国产ＤＮＡ聚合酶与进口ＤＮＡ聚合酶同样都能适用于直接ＰＣＲ扩增体系，因此，以国产ＤＮＡ聚合酶为基础建立直接ＰＣＲ扩增体系初步成功，这不仅确保了我们后续实验的进行，也使我们为对将来开发生物战剂现场快速检测装置充满信心，同时避免了在战争等特殊情况下受材料来源的限制。本部分研究结果表明，某些ＰＣＲ添加剂的确能帮助直接以菌液为模板的ＰＣＲ扩增，从而使我们能够建立无须ＤＮＡ提取纯化步骤的直接ＰＣＲ扩增体系。所建立的直接ＰＣＲ扩增体系能有效从菌液中扩增目的核酸片段，这不仅确保了我们后续实验的进行，也使我们对自主开发现场生物战剂快速检测装置感到信心百倍，同时避免了在战争等特殊情况下受材料来源的限制。第三军医大学硕士学位论文第二部分直接ＰＣＲ扩增体系应用研究采用第一部分建立的直接ＰＣＲ扩增体系，我们对噬菌体（病毒）、带有ｐＵＣｌ８质粒的ＤＨ５ａ菌株（细菌）等原核细胞及真核生物细胞（人Ａ５４９细胞）进行了直接ＰＣＲ扩增，以检验该直接ＰＣＲ扩增体系能否有效扩增不同类型细胞中的目的核酸片段；采用第一部分建立的直接ＰＣＲ扩增体系，我们对以三蒸水、生理盐水、尿液、血液等不同溶液稀释的带有ｐＵＣＩ８质粒的ＤＨ５Ｑ菌株菌液进行了直接ＰＣＲ扩增，以检验该直接ＰＣＲ扩增体系对来源类型标本中的目的核酸片段能否有效扩增。我们还将此直接ＰＣＲ扩增体系与国产的淋球菌４。ＣＰＣＲ检测试剂盒作对比，以检验该直接ＰＣＲ扩增体系在简化操作步骤、节省检测时间、减少所用仪器、降低检测成本的基础上的检测灵敏度和特异性。材料与方法一、主要仪器、试剂及其配制：ＰＣＲ反应及结果检测部分主要仪器、试剂及其配制同第一部分，其中直接ＰＣＲ反应体系如第一部分表６所示。淋球菌４。ＣＰＣＲ检测试剂盒（华美、中国）二、细菌、细胞培养及其他相关准备工作：（１）带有ｐＵＣｌ８质粒的ＤＨ５ｎ菌株划线于含氨苄青霉素的ＬＢ琼脂板上，３７＂Ｃ培养过夜。（２）在超净工作台上，以接种针分别挑取１个单菌落溶于含１０ｕｌ生理盐水的２０个ＥＰ管中，置４４Ｃ保存，备后续直接ＰＣＲ使用。（３）在超净工作台上，以接种针分别挑取１个单菌落溶于含１０ｎＩ尿液的２０个ＥＰ管中，置４。Ｃ保存，各后续直接ＰＣＲ使用。（４）在超净工作台上，以接种针分别挑取１个单菌落溶于含１０个ＥＰ管中，置４。Ｃ保存，备后续直接ＰＣＲ使用。（５）在超净工作台上，对所准备的１０ｔ－Ｉ１不同溶液溶解的直径１ｍｍ的单菌落（计１０６个细菌）作倍比稀释。方法为分别从表７各列中左边－－Ｙ０经混匀后的菌液中吸取１ｕｕｌ抗凝全血的２０１，加入到右边一列准备好的对应同种对应编号的９ｕｌ溶液中，混匀后再从该列的ｕ菌液中吸取１１，加入到右边一列准备好的对应同种对应编号的９ｌＸｌ溶液中，依次进第三军医大学硕士学位论文行，注意每次混匀溶液后更换吸头再进行溶液转移。表７中所示为操作后的最终菌液体积及推算浓度。做灵敏度检测时，分别将相同溶液溶解的相同浓度编号为１、２、３的菌液混匀后混合，做灵敏度检测时选用混合后混匀的菌液１释结果如下表所示：ｕｌ作为ＰＣＲ模板。稀表７不同溶液溶解的倍比稀释后不同浓度的菌液配制完毕后，置４℃保存备用。（６）ＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓａｅｍｇｉｎｏｓａｐｈａｇｅＰａＰ３为本校微生物教研室惠赠。该噬菌体为该室自行分离纯化、测序，并向ＮＣＢＩＧｅｎｅｂａｎｋ提交了序列，序列号为ＡＹ０７８３８２。赠品为与细菌共同培养，４＂Ｃ低温低速离一￡，（４０００ｒｐｍ，５分钟）后的上清液。未作进一步稀释处理，置４℃保存备用。ＰＣＲ反应中直接吸取１ｕｌ该上清液作为模板。（７）Ａ５４９细胞为人肺癌细胞株，由本校分子遗传学教研室惠赠。赠品为２５ｍｌ培养瓶培养的细胞，经弃上清，ＰＢＳ冲洗，Ｏ．２５％胰酶消化后，添加完全培养基约４ｍｌ终止消化。收集细胞并分装于４个１．５ｍｌＥＰ管中。低速离心，８００ｒｐｍ，５分钟，弃上第三军医大学硕士学位论文清，敞口倒置管于洁净吸水纸上８分钟，去痕量残液，每管加三蒸水１０ｕｌ溶解细胞团，置４℃保存备用。ＰＣＲ反应中直接吸取１ｕｌ细胞液作为模板。（８１５例淋球菌阳性标本由西南医院检验科惠赠。其处理方法为取女性患者富颈口分泌物棉拭子，以１．５ｍｉＥＰ管装Ｉｍｌ生理盐水充分洗涤棉拭子，贴壁挤出棉拭子中水分，弃棉拭子。经西南医院门诊检验科以镜检和分子生物学检测的方法确认为阳性。所得标本编号后，试剂盒维分别取上清液３００ｐｌ，参照淋球菌４＂ＣＰＣＲ检测试剂盒进行后续操作。直接ＰＣＲ组采用第一部分建立的直接ＰＣＲ扩增体系，模板为取上清液１ｕ１。（９）引物设计登录Ｇｅｎｅｂａｎｋ，查询噬菌体ＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓａｅｒｕｇｉｎｏｓａｐｈａｇｅＰａＰ３基因组全长序列（ＡＹ０７８３８２），人ｂｅｔａ—ａｃｔｉｎ基因全长序列（ＡＹ５８２７９９），人ＧＡＰＤ基因全长序列ｆＡＹ３４０４８４），淋球菌ｐＪＤｌ质粒全长序ＹＯ（Ｌ０８７５２），采用ＰｒｉｍｉｅｒＰｒｉｍｉｅｒ５．０引物设计软件设计引物序列，引物设计时注意避免发夹结构、引物二聚体、引物间二聚体、分子内非特异扩增等不良情形的出现，再经联网Ｂｌａｓｔ排除对分子间非特异扩增情形的发生，引物由中国上海生工合成，每条引物合成两个ＯＤ。对带有ｐＵＣｌ８质粒的ＤＨ５ａ菌株细菌核酸扩增所用引物仍为第一部分中所用引物。引物序列：Ｅ．ｃｏｌｉ（ＡＥ００５ｌ７７）Ｓｅｎｃｅｐｒｉｍｅｒ：Ａｎｆｉｓｅｎｃｅｐｒｉｍｅｒ：５’５７ＡＴＣＡＡＣＣＧＣＡＧＧＡＴＧＣＣＡＣＡＡＣＧＡＡＣＡＧＣＡＧＧＧＴＣＡＧＧＴＴＡＣＡＧ３３Ｐｒｏｄｕｃｔ：３９８ｂｐＴａ：５４．６℃ｐｈａｇｅ（ＡＹ０７８３８２）Ｓｅｎｓｅｐｒｉｍｅｒ：５’５７ＡＴＡＧＧＡＧＣＧＴＧＣＧＴＡＴＧＴＣＡＧＡＡＧＴＣＡＡＧＣＧＧＴＣＧＧＧＡ３’３’Ａｎｔｉｓｅｎｓｅｐｒｉｍｅｒ：Ｐｒｏｄｕｃｔ：４７７ｂｐＴａ：５６．３℃ＡＹ３４０４８４９（ＧＡＰＤ）Ｓｅｎｓｅｐｒｉｍｅｒ：５‘７ＣＴＴＡＧＡＴＴＴＧＧＴＣＧＴＡＴＴＧＧＧＧＧＡＡＧＡＴＧＧＴＧＡＴＧＧＧＡＴＴＴ３７Ａｎｔｉｓｅｎｓｅｐｒｉｍｅｒ：５３’Ｐｒｏｄｕｃｔ：２９８ｂｐ