第三军医大学硕士学位论文力作用下沉降到管底，从而使该组在不离心情况下结果与预加体系组或正常对照组并无明显差异。这样，在现场快速检测中，我们可以将除模板外的整个反应体系预先加入到反应管中，并滴加一滴矿物油覆盖，进行检测前只须再加适量模板而无须离心，将不仅减少现场快速检测的加样步骤，节省检测所需时间，还能避免现场艰苦条件下对离心机等仪器的依赖，减少人为操作频繁造成检测假阳性情况的发生。三、省略结果判读的电泳检测步骤对现场快速检测的影响常规ＰＣＲ结果的检测通常有以下几种方法：琼脂糖凝胶电泳、ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｌｏｔ、ＰＣＲ．Ｅｌｅｓａ，这些结果判别方法的缺点是步骤繁琐，耗费时间、精力和金钱，同时，对ＰＣＲ产物的操作，容易造成人为污染。当产物扩增同时就能识别结果的方法出现后，上述ＰＣＲ结果判别的方法很大程度上得到了替代，就是现在常说的实时荧光定量ＰＣＲ（ｒｅａｌｔｉｍｅＰＣＲ）［４０】。实时荧光定量ＰＣＲ的发展得益于在扩增同时使用荧光标记引物、探针或扩增产物。与同位素标记相比，实时荧光定量ＰＣＲ不存在放射性污染的问题。常用的荧光标记方法可根据荧光强度对应的是特异扩增与否分为非特异性荧光标记和特异性荧光标记两类［４０】。序列非特异性标记采用能与ＤＮＡ双链分子结合，在～定波长的光照下激发荧光的物质，这些是早期应用于实时荧光定量ＰＣＲ的分子，常见的包括：溴化乙锭、ＹＯ．ＰＲＯ．１和ＳＹＢＲ⑩ＧｒｅｅｎＩ。这些物质优点是适用范围广、价格低廉，但是，缺点是非特异性扩增或引物二聚体等能够明显对结果的判读产生干扰。ＳＹＢＲ⑩ＧｒｅｅｎＩ是一种只与ＤＮＡ双链结合的荧光染料，当它与ＤＮＡ双链结合时，发出荧光；从ＤＮＡ双链上释放出来时，荧光信号急剧减弱【４”。因此，在一个体系内，其信号强度代表了双链ＤＮＡ分子的数量。ＳＹＢＲ＠ＧｒｅｅｎＩ荧光染料法定量ＰＣＲ的基本过程是：１．开始反应，当ＳＹＢＲ⑧ＧｒｅｅｎＩ染料与ＤＮＡ双链结合时发出荧光。２．ＤＮＡ变性时，ＳＹＢＲ＠ＧｒｅｅｎＩ染料释放出来，荧光急剧减少。３．在聚合延伸过程中，引物退火并形成ＰＣＲ产物。４．聚合完成后，ＳＹＢＲ＠ＧｒｅｅｎＩ染料与双链产物结合，定量ＰＣＲ系统检测到荧光的净增量加大。本部分实验结果表明，使用ＳＹＢＲ＠ＧｒｅｅｎＩ荧光染料，阴性对照组１无明显荧光。阴性对照组２和正常对照组荧光信号均很强。阴性对照组１：因没加模板，不能进行有效ＤＮＡ扩增，体系中无明显ＤＮＡ双链结构。而阴性对照组２虽因不加ＤＮＡ聚合酶，不能进行有效ＤＮＡ扩增，但是因加了模板，模板中含有的大量ＤＮＡ双链分子形第三军医大学硕士学位论文成了很强的背景，以致从肉眼角度无法同正常对照组真正区分开来。看来非特异性荧光染料并不适合该直接ＰＣＲ扩增体系。针对生物战剂的现场ＰＣＲ快速检测装置因为要经样本采集装置收集样本，也必然向反应体系中引入大量双链ＤＮＡ，非特异性荧光染料同理并不适用，但可采用目前技术已经成熟的实时荧光定量ＰＣＲ中所采用的荧光探针［４２．５０ｌ。采用了两端分别耦联发光基团和淬灭基团的荧光探针，虽然使成本大大提高，但是检测的特异性因得引物与探针双重保证，也必然明显增强，同时，采用便携式紫外照射仪即可激发荧光，迅速判读扩增结果，应当能够很好满足现场快速检测的需要。四、开发生物战剂现场ＰＣＲ自动化快速检测系统可行性的探讨真正满足生物战剂现场快速检测需求的是成功开发生物战剂现场ＰＣＲ自动化快速检测系统，因为只有在保持ＰＣＲ检测高灵敏、高特异、快速、简便优点基础上实现ＰｅＲ检测的自动化，才能真正实现高通量、高速度检测。同时，对检测和诊断人员的安全性问题也是很好的解决。但是，几个“瓶颈”限制了ＰＣＲ检测的自动化，这包括：标本的预处理过程中的离心和影响反应酶活性的变性剂的引入、高通量检测过程中的微量加样和自动化控制、及反应结果的判读所需的凝胶电泳步骤等。在我们研究建立的直接ＰＣＲ扩增体系疏通ＰＣＲ自动化标本预处理主要“瓶颈”一预处理的的基础上，结合当前其他相关的研究进展，开发生物战剂现场ＰＣＲ自动化快速检测系统的条件已经基本具备。我们可将生物战剂现场自动化ＰＣＲ检测系统拆分为以下几个部分：样本自动采集系统、机械臂自动微量加样系统、ＰＣＲ反应体系、自动化热控循环系统、ＰＣＲ结果判读系统和结果输出系统。如果能够实现这几个部分的自动化耦合，即可真正实现ＰＣＲ检测的全自动化。我们的研究范畴直接ＰＣＲ扩增体系属于ＰＣＲ反应体系部分，在自动化ＰＣＲ系统中，须与此部分进行自动化耦合的有样本自动采集系统、机械臂自动微量加样系统、ＰＣＲ反应体系、自动化热控循环系统、ＰＣＲ结果判读系统。样本自动采集系统通常可以采取正压或负压的原理，过滤浓缩，洗涤成液。在第二部分我们研究的优化后直接ＰＣＲ扩增体系对对不同溶液稀释菌液扩增效果及灵敏度检测可以为直接ＰＣＲ扩增体系与此部分相耦合，选择相应的洗涤液作提示。为了将直接ＰＣＲ扩增体系与自动化热控循环系统相耦合，确保升温降温的灵敏性，反应体系不宜过大，因此，就需要微量加样。同时，由于自动化ＰＣＲ系统通常还具有高通量和高速度的属性，即快速的对多个目的核酸分子进行检测，因此，须对直接ＰＣＲ扩增体系加样操作步骤尽量简化，以第三军医大学硕士学位论文便与机械臂自动微量加样系统相耦合，第三部分我们为适应现场快速检测对加样操作的简化使得在现场只须再加模板，可很好与与机械臂自动微量加样系统相耦合。一般情况下，ＰＣＲ检测的结果判读采用琼脂糖凝胶电泳方法进行检测，但是，该检测方法不利于ＰＣＲ的自动化，自动化ＰＣＲ系统须采用新的结果判读方式，以取消电泳检测步骤。尽管我们在第三部分的实验中中证实非特异性荧光染料不适合用于现场快速检测的结果面判读系统，但是近年发展迅速的实时荧光定量ＰＣＲ技术所采用的特异荧光标记探针检测技术则应该能够很好的适应需求。通过本研究证实，应用该直接ＰＣＲ扩增体系无须常规ＰＣＲ操作标本预处理过程中的核酸提取与纯化，疏通了自动化ＰＣＲ系统中一个主要“瓶颈”。在疏通自动化ＰＣＲ主要“瓶颈”一标本预处理的基础上，我们也为跨越其他的障碍找到了解决办法：如：采用直接ＰＣＲ扩增体系，则无须繁琐的标本预处理过程；耦合样本自动化采集富集系统，可以保证检测的高度灵敏性；采用ＰＣＲ引物和荧光探针双重技术，可以保证ＤＮＡ扩增的高度特异性；借鉴多重ＰＣＲ技术，可以在相同循环参数条件下迅速有效检测多个指标：借鉴实时荧光定量ＰＣＲ技术，可以解决ＰＣＲ反应的结果判读问题；我们有理由相信，再结合互联网上的核酸信息、我国自主生产芯片的自动化控制能力和我国强大的机械加工制造能力，自主开发现场生物战剂自动化检测系统的条件已经基本具备。现场生物战剂自动化快速检测系统的研发成功，必然大大增强我国的国防实力。本部分研究结果表明，该直接ＰＣＲ扩增体系不仅能够适应现场快速检测简化操作步骤、节省检测时间、减少所用仪器、降低检测成本的需求，还能应用于直接多重ＰＣＲ检测，同时单管扩增多个目的核酸片段，且对加样操作的进一步简化对结果并无不良影响，与近年发展迅速的实时荧光定量ＰＣＲ技术相结合，虽然采用非特异性荧光染料并不适合，但是技术成熟的荧光探针技术理当有效解决快速结果判读问题，使我们完全能够开发出基于直接多重ＰＣＲ检测技术的便携式现场快速检测装置。为真正适应高通量、高速度、高灵敏、高特异、高安全的针对生物战剂现场快速检测的需要，在我们研究的基础上，再结合互联网上的核酸信息、我国自主生产芯片的自动化控制能力和我国强大的机械加工制造能力，还有望开发生物战剂现场自动化快速检测系统。第三军医大学硕士学位论文全文结论１．成功建立了直接ＰＣＲ扩增体系，有效解决了ＰＣＲ技术现场核酸快速检测应用的主要瓶颈标本预处理问题。２．直接ＰＣＲ扩增体系即无须对样本进行预处理，避免抑制反应酶活性的变性剂引入和高速离心步骤，能够对样本中目的核酸片段直接扩增的反应体系。３．该直接ＰＣＲ扩增体系对以三蒸水和生理盐水为溶解体系的原核细胞溶液中目的核酸片段能够保证扩增的特异性和敏感性，适用于直接多重ＰＣＲ扩增，对其操作步骤进一步简化的成功，表明该直接ＰＣＲ扩增体系尤其适用于现场快速检测未知种类的气溶胶型生物战剂。４．在本研究的基础上，有希望成功研发生物战剂现场快速检测装置。