8在实际生产中如何通过实验确定发酵的最佳pH？发酵过程的pH控

制可以采用哪些措施？ 答：选择最适发酵pH的准则是获得最大比生产速率和适合的菌体量，以获得最高产量，所以在实验中我们可以通过测定平均得率系数来确定最佳ph，例如以利福霉素为例：当pH＝7.0时，平均得率系数最大，在破pH＝6.5时其为最小值，故pH＝7.0是生产利福霉素的最佳pH。

发酵过程的pH控制有一下措施：

1. 2. 3. 4. 5.

配制合适的培养基，调节培养基初始pH至合适范围并使其有很好的缓冲能力。 培养过程中加入非营养基质的酸碱调节剂，如CaCO3等防止pH过度下降。 培养过程中加入基质酸碱调节剂，如氨水等。 加生理酸性或碱性盐基质，通过代谢调节pH。

将pH控制与代谢调节结合起来，通过补料来控制pH。

在实际生产过程中，一般可以选取其中一种或几种方法，并结合pH的在线检测情况对pH进行有效控制，以保证pH长期处于合适的范围。

9发酵过程糖代谢、氮代谢有什么规律？

糖代谢一般都按照三羧酸循环进行,即各种糖类物质先分解成葡萄糖,然后从葡萄糖开始进入TCA循环,到生成丙酮酸,再到柠檬酸循环,中间各种代谢产物都可以作为一些脂类,蛋白质类等合成的中间物. 有氧条件下，丙酮酸进入线粒体氧化脱羧转变为乙酰辅酶A，同时产生1分子NADH+。乙酰辅酶A进入三羧酸循环，最后氧化为CO2和H2O。 在厌氧条件下，可生成乳酸和乙醇。同时NAD+得到再生，使酵解过程持续进行.在发酵过程中还存在迟效碳源和速效碳源之分;迟效碳源一般是在发酵过程中让菌体产生代谢产物是发挥作用,而速效碳源是为了使微生物能够大量快速地繁殖而用的.供给微生物的培养基中不同的C/N比就产生不同的影响.当C/N林大时,是为微生物的繁殖,当C/N比相当小点时是为了生产代谢产物,如生产氨基酸.

10．发酵过程为什么要补料？

基质的种类和浓度直接影响到菌体的代谢变化和产物的形成,在实际发酵过程中基质的浓度主要依靠补料来维持,以达到如下目的:

解除基质过浓的抑制; 解除产物的反馈抑制; 解除分解代谢物阻遏作用;

避免因一次性投糖过多造成细胞大量生长,耗氧过多而造成波谷现象; 在生产上补料还经常作为纠正异常发酵的一个重要手段.

11．机械搅拌发酵罐中，搅拌器作用是什么？搅拌转速的高低对不同种类微生物的生长，代谢有何影响？ 作用：

1打碎气泡，增加气液接触面积

2产生涡流，延长气泡在液体中的停留时间

3造成湍流，减小气泡外滞流液膜的厚度

4动量传递，有利于混合及固体物料保持悬浮状态

转速高,有利于氧的溶解,可以促进好氧微生物的生长,但对非好氧类微生物会有不利影响;反之则然.对于黏度大，菌丝易结团的非牛顿型发酵液，以采用大叶径、低转速、多组搅拌器较好；对于黏度小，菌体易分散均匀的牛顿型发酵液，以采用小叶径、高转速较好。

12发酵中泡沫形成的原因是什么？泡沫对发酵有哪些影响？

原因：在发酵过程中因通气搅拌与发酵产生的CO2 以及发酵液中糖、蛋白质和代谢物等稳定泡沫的物质产生。

影响：1降低发酵罐的装料系数。发酵罐的装料系数一般取0.7(料液体积/发酵罐容积)左右,通常充满余下空间的泡沫约占所需培养基的10%,且其成分也不完全与主体培养基相同.

2增加菌群的非均一性。由于泡沫高低的变化和处在不同生长周期的微生物随泡沫漂浮或黏附在罐壁上,使这部分菌体有时在气相环境中生长,引起菌的分化甚至自溶,从而影响了菌群的均一性.

3增加了污染杂菌的机会。发酵液溅到轴封等处,容易染菌

4大量起泡如果控制控制不及时会引起”逃液”会导致产物的流失.

5消泡剂的加入有时会影响发酵产量或给下游分离纯化与精制工序带来麻烦

13.泡沫的控制方法可分哪两大类?请简述之

答：泡沫的控制方法可分为：机械消泡和消泡剂消泡两大类。

（1） 机械消泡：借助机械搅拌起到破碎气泡消除泡沫的作用。

（2） 消泡剂消泡：在工业发酵过程中，通常利用添加消泡剂的方式来消除

泡沫。

14对消泡剂有哪些要求?常用的消泡剂有哪几类?对于黏稠的发酵液应选什么样的消泡剂?对于较稀的发酵液又应选什么样的消泡剂?植物油的消泡机理是什么? 答：消泡剂必须有符合以下要求：

（1） 消泡剂必须是表面活性剂，且具有较低的表面张力，消泡作用迅速，

效率高。

（2） 消泡剂对气液界面的散布系数必须足够大，才能迅速发挥它的消泡活

性，这就要求消泡剂具有一定的亲水性。

（3） 消泡剂在水中的溶解度较小，以保持其持久的消泡或抑泡性能。 （4） 对发酵过程无毒，对人、畜无害，不被微生物同化，对菌体生长和代

谢无影响，不影响产物的提取和产品质量。

（5） 不干扰溶氧、PH等测定仪器的使用。 （6） 消泡剂来源方便，价格便宜。

常用的消泡剂有：天然油脂类、聚醚类、高级醇类、和硅树脂类。

对于黏稠的发酵液应选亲水性好的、具有较低表面张力、在介质中容易铺展的消泡剂。

对于较稀的发酵液应选具有较低表面张力、在水中溶解度小的、可持久利用的消泡剂。

植物油的消泡机理是：植物油借助其低表面张力的作用自发进入液膜内并在界面上迅速铺展、分散，进而改变液膜的界面性能，最终导致泡沫的破裂。

15准确判断发酵终点有什么好处?依据哪些参数来判断?

答：准确判断发酵终点可以提高产品质量和经济效益，依据最大比生长速率，放罐修检工作时间，洗罐、配料和灭菌时间，生长停滞时间，菌体起始浓度，放罐菌体浓度等参数来判断。

16高密度培养的意义是什么?高密度培养的措施有哪些? 答：高密度培养的意义是：在保持菌体最佳状态的情况下，使菌体量达到最大值，从而提高产量，达到高效生产的目的。

高密度发酵的措施有：

（1）使用最低合成培养基以便进行准确的培养基设计和计算生长得率，这有助于避免引入对细胞生长不利的养分限制；

（2）细胞生长速率要优化，使得碳源能充分利用并获得较高的产率，用养分流加来限制菌的生长速率还能控制培养物对氧的需求和产热速率；

（3）可用碳源作为限制性养分，因为其用量比其他养分大且易控制，为了能得到最大的细胞浓度和减轻连续恒化培养所带来的菌种不稳定等问题，宜采用补料分批发酵来实现高密度培养。

生物技术0504

十（胡艳芳）十一（帕孜来提、杨冬梅、杨晓芳）十二（张琦）

第十章

1、利用基因工程菌生产有哪些特点和优势？常用的宿主菌有哪 些？

答：基因工程菌利用现代生物技术，以细胞外进行DNA拼接、重组技术为基础以人们可控制的方式来分离和操作特定的基因，能创造新的物种，赋予微生物新的机能，使微生物生产出自身本来不能合成的新物质，或者增强它原有的合成能力，大大提升了发酵工业的技术水平，并带来可观的经济收入。常用的宿主菌有大肠杆菌和酿酒酵母。

2、重组菌基因不稳定性的原因是什么？

答：重组质粒引入宿主后引起宿主细胞和重组质粒的相互作用，基因工程菌所处的环境条件对质粒的稳定性和表达效率影响很大，可能导致重组DNA分子某一区域发生缺失、重排或修饰，或者整个重组DNA分子不稳定，从而使部分重组DNA分子子代细胞不带质粒。这些环境因素如培养基组成，培养基温度，菌体比生长速率等影响很大。

3、基因工程菌高效表达的障碍是什么？

答：选择适当的表达载体、外源基因不能含内含子、 外源基因与表达载体连接后必须形成正确的阅读框。

4、重组菌与传统微生物在产物表达上有什么区别？ 答：重组菌中外源基因在细胞中的表达形式多样，原核中主要有：非融合蛋白表达，融合蛋白表达，分泌型蛋白表达，包涵体等。非融合蛋白表达可直接产生天然的外源蛋白，便于产物的加工处理，但易被细菌细胞内的蛋白酶所降解。融合蛋白可获得高效表达，但后处理加工比较麻烦。分泌表达可提高外源蛋白的表达水平和对产物的纯化。包涵体的形成有利于外源蛋白的高水平表达，可防止蛋白酶对外源蛋白的降解，并避免外源蛋白对宿主细胞的毒害作用。

5、大肠杆菌与酵母作为宿主菌各有什么特点？

答：原核生物的大肠杆菌生长迅速，极易培养，能在廉价的培养基中生长，其遗传学及分子生物学背景十分清楚。

酵母菌是研究基因表达调控最有效的单细胞真核生物，其基因组小，仅为大肠杆菌的4倍，生长繁殖迅速，容易培养，不产生有害物质，其遗传学及分子生物学背景十分清楚，基因工程操作方便。

6、重组菌与传统菌在发酵过程控制中有哪些异同点？

答： 区别：基因工程菌是高密度发酵，其发酵过程进行控制的关键在于宿主的生理遗传特性影响外源基因的表达，同时外源基因的表达又影响宿主的生长特性。重组大肠杆菌的高密度、高表达的过程控制中研究糖耗速率、补料速率与重组菌的生长、表达的关系，温度、微量元素对质粒稳定性、基质运输、外源蛋白的可溶性，使外源蛋白的表达量大大提高。

相同点：发酵过程中影响发酵的因素一样，同样要考虑发酵设备的选择，发酵培养基的选择，培养方式的选择，溶氧的控制，温度的影响和控制，pH的影响和控制等。

7、重组大肠杆菌的诱导因子有哪些？重组酵母的诱导因子有哪些？

重组大肠杆菌的诱导因子有：Lac、Trp以及PL 、PR等。 重组酵母的诱导因子有：CMV、RSV、SV40等