2008/11/09 09:55PI、Hoechst33342均可与细胞核DNA（或RNA）结合。但是PI不能通过正常的细胞膜，Hoechst则为膜通透性的荧光染料，故细胞在处于坏死或晚期调亡时细胞膜被破坏，这时可为PI着红色。正常细胞和中早期调亡细胞均可被Hoechst着色，但是正常细胞核的Hoechst着色的形态呈圆形，淡兰色，内有较深的兰色颗粒；而调亡细胞的核由于浓集而呈亮兰色，或核呈分叶，碎片状，边集。

故PI着色为坏死细胞；亮兰色，或核呈分叶状，边集的Hoechst着色的为调亡细胞。电子天平准确称取1mg 碘化丙啶（propidium iodide，PI）溶于10ml PBS（PH 7.2），成100ug/ml的储备液，用前等量混合（注意避光）

protocol:

1、收集细胞，数量需1－2×10E6个（悬浮细胞直接吹起即可，对于贴壁细胞用胰酶消化时，最好用DMEM+胰酶消化,且消化过程中不要去移动瓶子，防止消化所形成的细胞团影响后面的染色及分析），离心，11,000rpm，5min。

2、 用1ml 冰冷的PBS重悬后，离心：11,000rpm，5min。

3、用200μl冰冷的PBS重悬后，用加样器混匀后，缓慢的加入含有4ml冰冷的70％乙醇的10ml离心管中，边加边摇匀。－20℃，过夜。（或者置4℃，1h后进行下一步）

4、1,500rpm，10min，小心弃上清后，用1ml冰冷的PBS重悬，1,500rpm，5min。小心弃上清。

5、 加入含有40μg/ml 的PI，100μg/ml的RNase的PBS溶液500μl，37℃，培养30min－1h。

混匀。

溶液配方：PBS 910μl

PI 80μl

RNase 10μl

共1ml

6、过滤，供流式检测。

Hoechst 33342/PI双染色法

紫外光激发, Hoechst-PI双染在荧光显微镜下可见4 种细胞形态: 活细胞(VN) ,染成蓝色,核呈正常结构;

早期凋亡细胞(VA) ,染成蓝色,核呈固缩状或圆珠状;

晚期凋亡细胞(NVA) ,也被染成红色,但可见明显的染色质凝集。

非凋亡的死亡细胞(NVN) ,染成红色,核呈正常结构; 贴壁细胞：

1、培养细胞中加入hoechst染液，终浓度5μg/ml；

2、37℃，避光染色10min，

3、继续加入的PI染液，终浓度15μg/ml，

4、4℃，避光反应10min，

5、荧光显微镜下观察，照相。

悬浮细胞：

1.悬浮生长的细胞在培养状态下加入Heochst 33342，终浓度为1μg/ml；帖壁生长的细胞用含有0.02％EDTA的0.2

5％胰蛋白酶消化成单细胞悬液，离心，弃上清，用1ml全培养液重悬细胞，加入Heochst 33342，终浓度为1μg/

ml，37℃孵育7～10min。

2．4℃ 500～1000r/min离心弃去染液。

3．加入1.0ml PI染液，4℃避光染色15min。

4．400目的筛网过滤1次。

5．流式细胞仪分析。

另外这是活细胞染色，还有固定后染色的：细胞处理完毕用甲醇：冰醋酸（3：1）在4度固定5min后，PBS漂洗，进行以上操作。

先染色后固定：

Hoechst33258染色法

1．原代细胞培养，细胞学涂片或细胞甩片机制备的单细胞片。

2．细胞固定液4℃固定5min。

3．蒸馏水稍洗后，点加Hoechst33258染色液，10min。

4．蒸馏水洗片后，用滤纸沾去多余液体。

5．封片剂封片后荧光显微镜观察。

Hoechst33342染色法

1．将Hoechst33342加入培养的细胞中，终浓度为10μg/ml 37℃孵育30min。

2．4％的多聚甲醛和培养液以1：3混合，使多聚甲醛的浓度为1％，固定细胞5～10min。

3．固定好后，将细胞悬液涂在载玻片加盖玻片。

4．荧光显微镜激发滤片选用UV激发滤片，阻断滤片为400～500nm。

以上是先将细胞染色后再行固定观察的方法，也可先固定后染色：

1．收集（0.5～3.0）×106个细胞，500～1000r/min，离心5min去上清。

2．PBS洗1次，500～1000r/min，离心5min去PBS。

3．用3％多聚甲醛50μl重悬细胞，室温下固定10min。

4．PBS洗1次，500～1000r/min离心5min去PBS。

5．用15μl的Hoechst33258或33342重悬细胞，终浓度为16μg/ml，孵育15min。

6．取10μl放在玻片上，荧光显微镜下观察，可数500个细胞，计算调亡率。

注意事项：

1、－２０度７０％乙醇固定细胞过夜，固定后可以放在－20度冰箱，一般能保存几个月；

2、染色前要用DNA抽提缓冲液（PC buffer）作用５分钟，；

3、加ＰＩ的量按照1×PI，106个细胞5ul ；

4、加RNAase是为了消化RNA，以免影响DNA分析的结果。

操作过程，不用一定强调无菌，但是干净点没错的。

一般来说都采用 用Hoechest-PI双染，正常细胞对染料有拒染性，萤光着色浅，凋亡细胞主要摄取Hoechest染料呈现强兰光，而坏死细胞主要摄取PI呈红色荧光。

我的细胞已经做了盖玻片在六孔板里面的爬片 并且加了95%酒精固定 下一步打算做Hoechst-PI双染检测细胞凋亡 请教具体步骤 以及药物浓度 是不是这样 固定后

1.用PBS漂洗，加入hoechst染液，终浓度5μg/ml；

2、37℃，避光染色10min，

3、继续加入的PI染液，终浓度15μg/ml，

4、4℃，避光反应10min，

5、荧光显微镜下观察，照相。激发波长：hochest用紫外激发；PI用绿光激发

荧光显微镜下观察并计数凋亡指数（apoptotic index：percentage of apoptotic cells）。每个样本随机观察4个视野进行计数。计数1000个细胞，凋亡指数＝凋亡细胞数/1000 ×100％。凋亡指数取前后2次计数的平均值。实验重复3次。

其中hoechsts33258用于细胞固定后再染色，而hoechst33342则可以对活细胞直接进行染色！ 暂时了解了这么多，希望做过或是会做的大侠不吝赐教

PI分析细胞周期及凋亡率 1、200×g离心10min收集细胞；

2、弃去上清，PBS漂洗一次，将细胞重悬于预冷的80%乙醇中，-20°C固定24h以上； 3、进行流式细胞仪检测前，200×g离心10min收集固定后的细胞； 4、PBS洗涤一次，200×g离心10min收集细胞；

5、将细胞重悬于含100ug/ml RNase A和50ug/ml PI的PBS中，室温孵育30min；

6、将经PI染色和RNase A消化后的细胞悬液用过滤后即可利用流式细胞仪进行细胞周期分布和凋亡细胞定量的分析。

三、试剂盒以外自备仪器和试剂

荧光显微镜或流式细胞仪、低速离心机、微量移液器、1.5m L离心管、载玻片、盖玻片 四、保存条件：

4℃保存，Hoechst 33342和碘化丙啶需避光保存。 五、注意事项：

1、 荧光染料都存在淬灭的问题，建议染色后尽量当天完成检测。活细胞或组织染色后宜立即观察。

2、 在红色荧光对兰色荧光散点图上，还可见到细胞凋亡区向细胞坏死区迁移的轨迹，可能是凋亡细

胞的DNA进一步降解的缘故。

3、 用Heochst 33342染料与细胞孵育的时间不宜过长，一般控制在20min之内为宜。如果太长可引

起Heochst 33342的发射光谱由蓝光向红光的迁移，导致红色荧光与兰色荧光的比例改变，从而影响结果的判断。染色时间严格控制，染色过久可导致假阳性。 4、 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。 六、操作规程

1、 溶液A工作液的配制：

使用前，取试验盒中10×溶液A原液用蒸馏水稀释10倍，即得溶液A工作液。

2、 按照常规的方法收集5×105左右的细胞， 将细胞悬浮于1mL培养基中，再加入10μL Heochst 33342

溶液，混匀，37C孵育5～15 min。

3、 第2步的细胞于 4C离心（2000rpm，5min）弃去上清液。

4、 往第3步的细胞中加入1.0mL溶液 A工作液，加入5μL PI染液，室温避光放置5～15min后混匀； 5、 观察与分析

a、荧光显微镜观察：

Heochst 33342用氪激光激发的紫外光，激发波长为352nm，发射波长为400～500nm，产生兰色荧光；PI用氩离子激光激发荧光，激发光波波长为488nm，发射光波波长大于630nm，产生红色荧光。 b、 流式细胞仪分析：

Heochst 33342用氪激光激发的紫外光，激发波长为352nm，发射波长为400～500nm，产生兰色荧光；PI用氩离子激光激发荧光，激发光波波长为488nm，发射光波波长大于630nm，产生红色荧光。分析兰色荧光对红色荧光的散点图或地形图。 结果判断：在兰色荧光对红色荧光的散点图上，结果为：正常细胞为低蓝光/低红光，凋亡细胞为高蓝光/低红光，坏死细胞为低蓝光/高红光。

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基本原理

经固定的凋亡细胞其染色体荧光染料的DNA可染性性下降。细胞一经固定就不再是活细胞，而且细胞固定过程对细胞膜的通透性也有影响。因此发展了用“细胞活性”鉴定染料染色的流式细胞仪检测方法。这些方法细胞不经固定就直接用DNA染料染色，且染料的浓度要比固定细胞所用的浓度要低得多。流式细胞仪通常根据细胞膜完整性将细胞分为“活细胞”和“死细胞”，因此正常细胞和凋亡细胞归为活细胞。活细胞染料如Hoechst 33342能少许进入正常细胞膜而对细胞没有太大得细胞毒作用。Hoechst 33342在凋亡细胞中的荧光强度要比正常细胞中要高，Hoechst 33342在凋亡细胞中的荧光强度增高的机制与凋亡细胞膜通透性发生改变有关，凋亡细胞早期细胞膜的完整性没有明显性改变，但细胞膜的通透性已有增强，因此进入凋亡细胞中的Hoechst 33342比正常细胞的多。此外，还与凋亡细胞的染色体DNA的结构发生了改变从而使该染料能更有效地与DNA结合以及凋亡细胞膜上的p-糖蛋白泵功能受到损伤不能有效地将Hoechst 33342排出到细胞外使之在细胞内积累增加等有关。既然Hoechst 33342进入凋亡细胞中比正常细胞更容易，而EB、PI或7-AAD等染料是不能进入细胞膜完整的活细胞中，即正常细胞和凋亡细胞在不经固定的情况下对这些染料是拒染，坏死细胞由于膜完整性在早期即已破损，可被这些染料染色。根据这些特性，用Hoechst 33342结合PI或EB等染料对凋亡细胞进行双染色，就可在流式细胞仪上将正常细胞、凋亡细胞和坏死细胞区别开来。在双变量流式细胞仪的散点图上，这三群细胞表现分别为：正常细胞为低蓝色/低红色（Hoechst 33342+/PI+），凋亡细胞为高蓝色/低红色（Hoechst 33342++/PI+），坏死细胞为低蓝色/高红色（Hoechst 33342+/PI++）。 临床实验室

试剂与仪器

? Heochst 33342 染液：用PBS配成10ug/ml的储存液浓度，4℃避光保存；

? PI染液 ：用PBS配成5ug/ml浓度，4℃避光保存。 ? 400目的筛网 ? 流式细胞仪

实验步骤

1. 悬浮生长的细胞在培养的状态下加入Heochst 33342 ，终浓度为1ug/ml； 37℃孵育7—10min。

2. 低温500 ~ 1000r/min离心5min弃去染液。 3. 加入1.0ml PI染液，4℃避光染色15min。 4. 400目的筛网过滤1次。

5. 流式细胞仪分析：Heochst 33342用氪激光激发的紫外线荧光，激发光波波长为352nm，发射光波波长为400 ~ 500nm，产生兰色荧光；PI用氩离子激光激发荧光，激发光波波长为488nm，发射光波波长大于630nm，产生红色荧光。分析兰色荧光对红色荧光的散点图或地形图。

6. 结果判断：在兰色荧光对红色荧光的散点图上，结果为：正常细胞为低蓝光/低红光，凋亡细胞为高蓝光/低红光，坏死细胞为低蓝光/高红光。

注意事项

1. 在红色荧光对兰色荧光散点图上，还可见到细胞凋亡区向细胞坏死区迁移的轨迹，可能是凋亡细胞的DNA进一步降解的缘故。

2. 用Heochst 33342染料与细胞孵育的时间不宜过长，一般控制在20min之内为宜。如果太长可引起Heochst 33342的发射光谱由蓝光向红光的迁移，导致红色荧光与兰色荧光的比例改变，从而影响结果的判断。 clin-lab.文章来自临床实验室仪器信息网(www.Clin-Lab.Com) - 详文链接：http://www.clin-lab.com/html/xueye/liushi/liushiXx/201005/04-23933.html

细胞凋亡荧光Hoechst 33342 /PI 双染试剂盒

点击次数：1282 发布时间：2010-1-4 10:25:39

细胞凋亡荧光Hoechst 33342 /PI 双染试剂盒 一、原理

荧光染料 Hoechst 33342 能少许进入正常细胞膜，使其染上低蓝色，而凋亡细胞的膜通透性增强，因此

进入凋亡细胞中的Hoechst 33342 比正常细胞的多，荧光强度要比正常细胞中要高，此外，凋亡细胞的染色

体DNA 的结构发生了改变从而使该染料能更有效地与DNA 结合，并且凋亡细胞膜上的p-糖蛋白泵功能受到

损伤不能有效地将Hoechst 33342 排出到细胞外使之在细胞内积累增加等都使凋亡细胞的

蓝色荧光增强。而

PI 染料是不能进入细胞膜完整的正常细胞和凋亡细胞中，即活细胞对PI 染料拒染，而坏死细胞由于膜完整

性在早期即已破损，可被PI 染料染色。根据这些特性，用Hoechst 33342 结合PI 染料对凋亡细胞进行双染色，

就可在流式细胞仪上将正常细胞、凋亡细胞和坏死细胞区别开来。在双变量流式细胞仪的散点图上，这三群

细胞表现分别为：正常细胞为低蓝色/低红色（Hoechst 33342+/PI+），凋亡细胞为高蓝色/低红色（Hoechst

33342++/PI+），坏死细胞为低蓝色/高红色（Hoechst 33342+/PI++）。 二、试剂盒组份 组份 100 assays

Heochst 33342 染液1.0mL Propidium Iodide （PI） 500 ul 10×PBS 10 mL 三、操作步骤

1. 悬浮生长的细胞离心收集，固定培养的细胞消化收集后，将105~106 个细胞悬浮于1ml 培养基中，再加入

10ul Heochst 33342 染液，混匀，370C 孵育5-15 min； 2. 细胞于 40C 500 ~ 1000r/min 离心5min 弃去上清液； 3. 加入1.0ml PBS 悬浮细胞，加入5 ul PI 染液，避光混匀；

4 流式细胞仪分析或荧光显微镜观察：Heochst 33342 用氪激光激发的紫外光，激发波长为352nm，发射波长

为400 ~ 500nm，产生兰色荧光；PI 用氩离子激光激发荧光，激发光波波长为488nm，发射光波波长大于630nm，

产生红色荧光。分析兰色荧光对红色荧光的散点图或地形图。结果判断：在兰色荧光对红色荧光的散点图上，

结果为：正常细胞为低蓝光/低红光，凋亡细胞为高蓝光/低红光，坏死细胞为低蓝光/高红光。

四、注意事项

1. 在红色荧光对兰色荧光散点图上，还可见到细胞凋亡区向细胞坏死区迁移的轨迹，可能是凋亡细胞的DNA 进一步降解的缘故。

2. 用Heochst 33342 染料与细胞孵育的时间不宜过长，一般控制在20min 之内为宜。如果太长可引起Heochst

33342 的发射光谱由蓝光向红光的迁移，导致红色荧光与兰色荧光的比例改变，从而影响结果的判断。

3 Propidium Iodide （PI）有毒，操作时要戴手套 五、储存 置于 40C 避光，可保存一年。