3，生长与生产非偶联型

后菌体禁止期，产物大量生成。

抗生素等次级代谢产物，诱导型基因工程菌生产。 菌种选育及保藏 菌种的选育

1，自然选育：菌种—单孢子—平板分离—单菌落测活—优良菌种。 2，诱变育种：出发菌种—单孢子悬液—诱变处理—稀释涂板—单菌落初筛—高产菌株—复筛—稳定

性特性—放大中试—投入生产

3，杂交育种：

（1）体细胞重组育种（放线菌，半知菌纲的真菌）：两条菌丝—相互结合—异核体—二倍体—重

组单倍体

（2）结合育种（细菌，放线菌）

保藏方法：低温斜面保藏，石蜡封存，沙土管保藏，冷冻干燥保藏，

液氮保藏等液氮保藏：将保存菌种用保护剂制成菌悬液密封于安培瓶内，经控制速度冻

结后，储藏在-196~-150℃ 的液态氮超低温冰箱中。

过程：将菌种悬浮液或琼脂培养片无菌地装入安培管后，用火焰将安培管上部溶封，浸

入水中检查有无漏洞，然后将已封口的安培管置冻结器内，在控制冻结速度为每分钟下降1℃ 的条件下，使样品冻结到-35℃ 。再用干冰和乙二醇冷冻剂冻至-78℃ 后，立即移到液态氮冰箱中保存。

依据在生产中的用途，可将培养基分为：

一，孢子培养基：基质浓度较低，无机盐浓度适量，以利于孢子形成，营养不宜太丰富，否则不利

于产生孢子。

二，种子培养基：用速效性，容易被利用的碳氮源和无机盐等物质，氮浓度不宜高。

三，发酵培养基：营养物质浓度和粘度适中，组成上完整，不同菌种和不同产物对培养基的要求差

异很大，组成和配方需要优化。

种子培养基要与发酵培养基相适应，主要成分接近，不能差异太大。 发酵过程的主要控制参数 物理参数：温度，罐压，空气流量，搅拌功率，粘度，密度，装液量，浊度，泡沫，补料流加速度。 生物，化学参数：菌体浓度，菌体RNA,DNA,ATP,ADP, AMP等含量,，溶解氧浓度，呼吸商RQ，

酸碱度，基质浓度，效价或产物浓度，前体或中间体浓度

影响温度的因素：

发酵热=生物热+搅拌热-蒸发热-辐射热-显热

一般抗生素发酵过程的最大发酵热为（3000~7000）X 4019kJ/(m3.h)

发酵对空气的要求：好氧微生物需要氧气供应，通入空气，连续一定流量的压缩无菌空气。 空气流量：一般0.1~2.0m3/min，压强：0.2~0.4Mpa.

空气质量：相对湿度小于70%，比培养基温度高10~30℃ ；洁净度100级或失败率0.1%。 名词解释：

前体：加入到发酵培养基中的某些化合物，被直接结合到目标产物分子中，而自身的结构无多大的变化。

杂菌：除生产菌以外的任何微生物。 污染：感染杂菌的培养或发酵体系。

消毒：杀灭清除病原微生物，达到无害化程度，杀灭率99.9%以上。

杀菌：杀灭或清除一切微生物，达到无活微生物存在的过程，杀灭率99.9999%以上。 灭菌：杀灭或清除一切微生物，达到无活微生物存在的过程，杀灭率99.999999%以上。

培养基分类： 按发酵过程中所处的位置和作用，培养基可分为：斜面培养基、平板培养基、种子扩大培养基、

发酵培养基、补料培养基。

培养基设计的一般原则 1，生物学原则：根据不同微生物营养和反应需求设计。 营养物质组成：较丰富，浓度适当。

成分之间比例恰当：C/N比适宜，有机和无机氮搭配合理。 原料之间：不能产生化学反应，适宜的pH和渗透压。

2，工艺原则：不影响通气搅拌，分离精制和废物处理，过程容易控制。 3，低成本原则：原料来源方便，质量稳定，质优价廉。

4，高效经济原则：满足菌体生长和合成产物的需求，最高得率，最小副产物。 培养基设计基本思路：

1、起始培养基：根据他人的经验和使用 2、单因素培养基：确定最适宜的营养成分

3、多因素培养基：各成分之间最佳配比和浓度优化

4、中视和放大试验：经过摇瓶、小型发酵罐到中试，最后放大到生产量。 综合考虑各种因素、产量、纯度、成本后，确定一个适宜的生产配方。 种子培养基的特点：

1、营养成分易于被菌体吸收利用，同时比较丰富完全，氮源和维生素含量稍高 2、营养成分是易于吸收的碳源和氮源。

3、应考虑下一步的发酵过程，缩短发酵的延滞期。 发酵培养基的特点： 1、除了具有菌体生长所必须的元素和化合物，还要有产物所需的特定元素、前体和促进剂等。 2、一般属于半合成培养基，氮源和碳源是天然原料。 影响培养基的因素： 1、原材料质量的影响 2、水质的影响 3、灭菌操作的影响 4、其他因素的影响 分批灭菌的灭菌过程： 1、加热升温

2、维持灭菌温度（15-30min，121℃） 3、冷却降温

注：每阶段对灭菌的贡献取决于时间长短。 分批灭菌的操作过程：

1、蒸汽预热：冷却管、夹套通入蒸汽。

2、入罐升温：取样管、放样管、空气管、通入空气

维持保温：120℃，罐压0.1MPa，排气。调节近汽和排气量，维持30min。

冷却降温：依次关闭排气、进汽阀。罐压低于空气压力后，通入无菌空气，夹套通入冷却水降温 连续灭菌的各部件作用：

预热罐：定容和预加热，70-90℃。

加热罐：培养基与蒸汽相混合，快速升到130-140℃ 维持器：维持灭菌时间5-7min

冷却器：培养基经过冷却水骤冷却，40-50℃输入灭菌的发酵罐中

分批灭菌操作特点： 不需要其他的附属设备，操作简便， 手动。 分批灭菌操作缺点：

加热和冷却时间较长，营养成分损失较多，罐利用率低，适合小批量生产规模。 连续灭菌的特点： 1、高温快速灭菌工艺，营养成分破坏的少 2、热能利用合理，易于自动化控制

3、不适合粘度大或固形物含量高的培养基灭菌 4、增加了连续灭菌设备及操作环节，增加染菌几率 5、对罐压要求高，一般为0.45-0.8MPa 空气灭菌工艺流程： 空气→粗过滤（采风口）→压缩机→储罐（空气预处理）→冷却器→旋风分离器→丝网分离器（X2）→加热器（出去空气中的水和油）→过滤器（空气过滤）[即真正的除菌] 储罐的作用： 1、维持压力 2、降温 3、储存空气 除水除油的设备： 1、旋风分离器 2、丝网分离器 3、换热器 空气流量：0.1-2.0（空气和营养液的比例）

空气质量：相对湿度70%、比培养基温度高10-30℃、洁净度100级或损失率10 1.种子制备 种子的逐级扩大培养过程，获得一定数量和质量的纯种过程. （1）孢子制备

（2）生产种子制备:以罐体积的10%放大投放 （3）发酵类型 （4）接种方式

种子活化：将保存菌种接种在固体培养基上，在适宜条件下培养，恢复其故有生物特性。 放线菌孢子：采用琼脂斜面培养基

霉菌孢子：大米、小米、玉米、麸皮等天然农产品做培养基。 细菌:采用碳源有限而氮源丰富的配方。 发酵的类型 一级发酵：将孢子或菌丝直接接入发酵罐。

二级发酵：经过一级种子罐，再到发酵罐。如谷氨酸的生产。 三级发酵：青霉素的生产。 四级发酵：链霉素的生产。

单种法：一只种子罐接种一只发酵罐。 双种法：两只种子罐接种一只发酵罐。

倒种法：从发酵罐中取出一定量发酵液，接种到另一个发酵罐中。 2培养技术 高密度培养：菌体浓度（干重）至少达到50g/L的一种理想培养。发酵工艺目标和方向。 优点：缩小发酵体积，增加表达量，成本低。 3、发酵培养的操作方式 1分批式操作 2流加式操作 3半连续式操作 4连续式操作 5灌流式操作

微生物的发酵生产水平取决与：生产菌种的性能与合适的环境条件，发酵过程的各种参数处于不断的变化状态，关键在于对过程的检测。

1、生物学参数 临界菌体浓度控制 临界菌体浓度：摄氧速率与氧传递速率平衡时的菌体浓度。菌体遗传特性与发酵罐氧传质特

性的综合反映。

控制的策略：中间补料，控制co2和O2量 2 物理参数：温度.压力 温度的检测与控制

发酵温度：发酵中的所维持温度再生长和生产的最适温度范围内。 测定：热电阻等热的条件下测定，温度计上读出； （1）发酵热的构成与计算发酵热=产生热-蒸发热 （2）温度的选择原则

选择最适温度并严格控制；不同菌种，不同温度。 两段变温发酵培养：生长阶段选择适宜的菌体生长温度，生产阶段采用最适产物生产温度。 后期降温控制：避免产物降解。

（3）温度的控制方式：降温冷却、冷却水、冷却盐水循环式冷却。 压力的检测与控制 罐压的影响：维持正压，防止污染；co2和O2的溶解度，不同生物对压力耐受不同。 控制：进出口阀门，进入或排出气体或空气流量

维持工艺所需压力：0.02-0.05MPa，灭菌时压力0.1MPa。 3化学参数 1基质浓度的检测与控制：发酵液中糖、氮、磷等发酵中营养物质的浓度 2 pH的检测与控制:用电极控制

3溶氧的控制：临界氧浓度，不影响呼吸或产物合成的最低溶氧浓度 影响供氧的因素（1）氧推动力（2）体积传递系数 泡沫形成原因如何处理 泡沫形成的原因：菌体生长差、代谢速度慢、接种物嫩或种子未及时移种而过老蛋白质类胶体物

质多，培养基灭菌时温度过高或时间过长，葡萄糖受到破坏产生的氨基糖会抑制菌体的生长，也会使泡沫大量产生。 处理的方法：

--机械消泡：机械强烈震动或压力变化使泡沫破碎。

1罐内消沫桨转动打破泡沫 2泡沫引出罐外

--化学消泡：原理，加入了消泡剂，降低了泡沫的液沫强度和表面黏度而破裂。 5 发酵终点的判断 最低成本获得最大生产能力的时间。 判断的原则: （1）经济原则：在最大生产率时，终止发酵，发酵总生产周期最短。

（2）产品质量原则：发酵时间短，营养物质有残留，补料或消泡剂残留，以允许的残量为标准；

发酵时间长，菌体自溶，改变发酵液性质，增加分离纯化难度，对抗生素，放罐前16小时停止补料和消沫。 发酵污染的检测与控制

染菌的原因：种子污染 培养基灭菌不彻底 空气带菌 设备及其附件渗漏 另外有20~30%的不明原因污染