湖北师范学院生命科学学院 细胞生物学实验指导

细胞，因未染色细胞核不易见到，其胞质中含有数量不等的兰色圆形小颗粒（即吞入的含台盼兰的淀粉肉汤所形成）；还可见少量黄色椭圆形有明显细胞核的鸡红细胞，慢慢移动玻片标本，仔细观察视野中的巨噬细胞表面，有的红细胞已部分被吞入；有的巨噬细胞内已吞入了一个或多个红细胞形成吞噬泡。

未被吞噬的鸡红细胞

吞噬了鸡红细胞的

巨噬细胞

【实验报告】

1．镜检时，你能在视野中看到几种类型的细胞？绘图说明巨噬细胞吞噬过程。 2．巨噬细胞将如何进一步处理被吞噬的红细胞？

实验九：小鼠骨髓染色体标本的制备与观察

【课前预习】

1．秋水仙素的作用是什么？ 2．0.4％的KCl溶液起什么作用？

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【目的要求】

掌握小鼠骨髓细胞染色体的制备方法，了解各操作步骤的原理；识别小鼠染色体的数目及特点。

【基本原理】

在真核生物中, 染色体的数量和形态具有物种的特异性, 迄今一直可以此作为物种分类的基本依据之一。染色体作为遗传物质-DNA的载体, 对生物的遗传、变异、进化和个体发生, 以及细胞的增殖和生理过程的平衡控制等都具有十分重要的意义。每一个物种的细胞一般都有一定数目、形状和大小的染色体。将体细胞核中全部染色体按照其大小、着丝粒位置，以至带型有序地排列起来，此模式图象排列即为核型（karyotype）或染色体组型。核型分析均是以中期染色体为标准，对制作出的染色体标本进行照相以获得染色体的显微图象，并将其剪裁排列即成。华裔学者庄有兴（Joe Hin Tjio）和瑞典学者A.Levan合作, 利用低渗法研究胎儿肺组织的染色体标本制做方法，终于在1956年首次确定了人类的染色体数目是46条，而不是前人所主张的48条，这为后来的人类核型研究奠定了基础。

自身正处于活跃分裂状态或用植物血球凝集素（phytohemagglutinin，PHA）处理后处于分裂状态的组织或细胞，均可用于染色体标本的制作与分析。在正常动物体中，精巢和骨髓均为是活跃分裂的组织，可不经PHA处理直接用来制作染色体标本。但在取材方面，精巢又比骨髓要简易一些。

骨髓细胞具有高度的分裂活性，经秋水仙素或秋水酰胺处理后，使分裂细胞阻断在有丝分裂中期，再经低渗处理、固定、滴片、染色等步骤，可制作较好的骨髓细胞的染色体标本。对于骨髓染色体标本的制作，一般包括以下几个要点：1）用一定剂量的秋水仙素破坏纺锤丝的形成，使细胞分裂停滞在中期，使中期染色体停留在赤道面处；2）用低渗法使将细胞膨胀，再经固定液固定，尽可能使染色体的结构保持不变，在滴片时细胞被胀破，使细胞的染色体铺展到载片上；3）空气干燥法可使使细胞的染色体在载片上展平，经Giemsa染色后便可观察到染色体的显微图象。

【实验用品】

1．器材：解剖器具、注射器、离心机、离心管、恒温水浴箱、载玻片、酒精灯等；

2．试剂 0.1%秋水仙素溶液、Carnoy’s固定液（甲醇：冰醋酸＝3：1）、0.075 mol / L KCI溶液、Giemsa染液等。 3．材料：小鼠

【方法步骤】

1．取小白鼠，于实验前3～4小时，腹腔注射秋水仙素（按每克体重4微克）。 2．用颈椎脱臼法处死小白鼠，取其股骨及肱骨，去掉骨上的肌肉。

3．将骨剪碎于10ml的0．075 mol/L氯化钾溶液中；剪碎吹打过滤于刻度离心管中（用两层擦镜纸过滤）。 4．放入37℃水浴锅中静置30分钟。

5．取出加入新配制的卡诺固定液（甲醇3：冰醋酸1）。用吸管轻轻混匀进行预固定，然后以1000转／分钟离心9分钟，弃去上清液。

6．加固 定液8毫升，混匀，静置20分钟，以1000转／分钟离心9分钟，弃去上清液。

7．加入新配固定液8毫升（视细胞多少而定）制成细胞悬液，用吸管吸取细胞悬液，滴2～3滴于预冷的载玻片上，并吹散细胞。将载玻片在酒精灯上微烤。再用电吹风将标本吹干（或空气干燥）。

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8．滴Giemsa染液6～8滴于载玻片上，室温下染色3分钟左右，自来水冲洗，用电吹风吹干（或空气干燥）。（注：蟾蜍染色体的制作方法基本相同）。

9．将制好的玻片标本在低倍镜下观察，然后换高倍镜找到分散良好的分裂相，再转油镜仔细观察。

【实验结果】

在显微镜下，染色体被染成紫红色，胞浆完全不着色。对于分散好的染色体, 其间相互散开, 短臂收缩适中, 二条姐妹染色单体大致平行分离, 着丝粒清晰可见。小鼠的染色体数为40条，多为端部和亚端部染色体，只有2对亚中部着丝粒染色体。

【实验报告】

1．通过对自己制做的小鼠染色体标本观察，总结小鼠染色体的形态特征。 2．对于分散好的染色体，进行染色体计数。

3．请你分析一下在本实验中造成染色体标本制作不佳的可能原因有哪些？

[附] 染色体标本制做质量不佳的可能原因：

1．秋水仙素用量太多或处理时间过长，都会导致染色体的过分缩短或着丝点迅速裂解，最终使染色体被破坏或溶解。

2．低渗处理极为重要，低渗液的量、处理时间均与细胞的数量有关。低渗过度时, 细胞会破裂，成膜上浮；不足时则染色体积在一起，因此，低渗处理直接影响染色体分散之好坏。

3．离心速度太高或离心时间过长。细胞团块不易打散；速度过低或离心时间过短, 使 细胞不易沉降，会失去大量分裂相。

4．固定液要随用随配, 固定彻底后再打散细胞团块, 否则细胞容易破碎, 染色体分散亦受到影响。 5．载玻片如有油脂或冷却不够亦影响的铺展。

固定（fication）

目的是保持细胞自然形态，防止细胞自溶和细菌所致的腐败；固定液能沉淀和凝固细胞内蛋白质和破下细胞内溶酶体酶，使细胞不但保持自然形态，而且结构清晰，易于着色。因此标本愈新鲜，固定愈及时，细胞结构愈清晰，染色效果愈好。

染 色

1．染色的目的和原理：染色的日的是借助于一种或多种染料，使组织和细胞内结构分别着不同的染色，这样在显微镜下能清楚地观察细胞内部结构，作出正确判断。

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组织细胞染色原理至今尚无满意的解释，可能是物理作用，也可能是化学作用，或者是两者综合作用的结果。染色的物理作用是利用毛细管现象，渗透、吸收和吸附作用，使染料的色素颗粒牢固地进入组织细胞，并使其显色。染色的化学作用是渗入组织细胞的染料与其相应的物质起化学反应，产生有色的化合物。

各染料都具有两种性质，即产生颜色；征收被组织形成亲和力。这两种性质主要由发色基因和助色基因所产生的。

发色基团：苯的衍生物具有可见光区吸收带。这些衍生物显不的吸收带与其价键的不稳定性有关，如对苯二酚为无色，当其氧化后失去两个氢原子，它的分子或则变为有黄色的对醌，这种产生颜色的醌式环称为发色基团。若一种化合物含有几个环，只要其中有一个醌式环就会发出颜色，称此发色基团为色原（chromogen）.

助色基团：是一种能使化合物以生电离作用的辅助原子团（酸碱性基团）。它能使染色的色泽进一步加深，并使其与被染色组织具有亲和力。助色基团的性质决定染料是酸性碱性。碱性染料具有碱性助色基团，在溶媒中产生的带色部分为带正电荷的阳离子，吻与组织细胞内带负电荷的物质结合而显色。如细胞核内的主要化学成分脱氧化核糖核酸易被苏木素染成紫蓝色，称嗜碱性。酸性染料具有酸性用力色基团，在溶酶中产生带色部分为阴离子，易与组织细胞内带正电荷部分结合而显色，此性质被称为嗜酸性，如细胞浆内订成分为蛋白质，易与伊红或橘黄结合呈红色或橘黄色。 2．常用染色方法：临床日常工作中较为常用的染色方法有下列3种：

（1）巴氏染色法：本法染色特点是细胞具有多色性颜色，色彩鲜艳多彩。涂片染色的透明性好，胞质颗

粒分明，胞核结构清晰，如鳞状上皮过度角化细胞胞质呈橘黄色；角化细胞显粉红色；而角化前细胞显浅绿色或浅蓝色，适用于上皮细胞染色或观察阴道涂片中激素水平对上皮细胞的影响。此方法的缺点是染色程序比较复杂。

（2）苏木精—伊红（hemotoxylin eosin,HE）染色法：该方法染色透明度好，核与胞质对比鲜明。染色步

骤简便，效果稳定。适用于痰液涂片，觖质核呈紫蓝色，胞质淡玫瑰红色，红细胞呈淡朱红色。 （3）瑞特—吉姆萨染色法（wrightgiemsaatain）；本方法多用于血液，骨髓细胞学检查。胞质内颗粒与核安

危质结构显示较清晰。操作简便。

实验十：染色体C-带技术

【课前预习】

1．染色体分带技术的类型及其应用？ 2．染色体C-带的含义、显带操作及其原理？

【目的要求】

1．了解染色体分带技术的类型及其应用

2．学习染色体C-带技术的显带操作及其基本原理

【基本原理】

C-带最初是着丝粒异染色质（centromere heterochromatin)带纹的简称，后来为结构异染色质（constitutive

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