湖北师范学院生命科学学院 细胞生物学实验指导

于1924年发明，简称为Feulgen法。因对DNA的显示反应具有高度专一性，故常被用来显示细胞内DNA的分布情况。

自Feulgen等发明该显示DNA的Feulgen反应法以来，其作用机制也久经研究和讨论，现已取得一致意见。其具体反应原理是，标本经稀盐酸水解后，DNA分子中的嘌呤碱基被解离，从而在核糖的一端出现了醛基。Schiff试剂中的无色品红可与醛基反应，形成含有醌基的化合物分子, 因醌基为发色团，故可呈现出紫红色。也就是说, DNA经稀酸水解后产生的醛基，具有还原作用，可与无色品红结合形成紫红色化合物，从而显示出DNA的分布。其反应机制如下图所示。

2HCl+Na2S2O5→2NaCl+SO2+H2SO3

【实验用品】

1．器材 显微镜、立式染色缸、水浴锅 2．材料 香柏油，擦镜纸，盖玻片，载玻片 3．试剂

1）schiff氏试剂 将0.5g碱性品红置入三角烧瓶内沸腾的蒸馏水中，时时摇动玻璃瓶，煮沸5min使之充分溶解，冷却至50℃时过滤，加入10ml 1mol/L HCl，冷至25℃时，加入0.5g偏重亚硫酸钠（Na2S2O3）无水亚硫酸钠（NaHSO3），在室温冷暗处至少放置24h（有时需2~3天），使其颜色退至淡黄色，密封瓶口，藏于暗处，最好保存于4℃冰箱中（可保存数月或更长时间）。在使用前加入0.5g活性碳, 摇1min, 用粗滤纸过滤，滤液应为无色；若液体颜色变为粉红色，便不能再用。

2）亚硫酸水（洗涤剂）：用200ml普通自来水（不要用蒸馏水, 以免引起误差）、10ml 10%的偏重亚硫酸钠水溶液和10ml 1mol/L HCl，三者在使用前混合，现用现配。

3）1mol/L HCl（水解用）：取82.5ml比重为1.19的盐酸加蒸馏水1000ml即成（应将盐酸缓缓加入水中）。

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【方法步骤】

【实验结果】

细胞核中的DNA呈鲜亮的紫红色反应，它不但反应出DNA存在的部位及其分布情况，而且还可从颜色反应的深浅，来判断DNA的相对含量。细胞质被亮绿复染成绿色，核仁通常为负反应；但在有些材料的细胞质中，DNA也会出现阳性反应。

小鼠肝切片Feulgen染色

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【实验报告】

1．绘图表示Feulgen反应的染色结果。 2．总结Feulgen反应染色结果的影响因素。

附：Feulgen方法应注意的几个问题：

1．对照切片的制做：进行Feulgen反应时, 一般要做一对照切片以便验证反应结果。对照切片应不经水解直接放在schiff剂内，且应为负反应。但需要注意的是，对照切片在schiff试剂中最多不要超过1 h （0.5 h即可)，时间过长，试剂本身的酸性也会使DNA水解，从而出现假的正反应。

2．固定剂的选择：以前很多人认为，选用的固定剂不应含有醛基或含有氧化剂。后来发现含醛基或氧化剂的固定剂对反应的专一性并没有影响。实践证明，一切好的组织学固定剂均适用于Feulgen反应。如Bhampy固定剂、Helly固定剂、Flemming固定剂、OsO4固定剂、Carnoy固定剂、zenker固定剂和Bouin-Aller固定剂。但在上述固定剂中，以OsO4和Carnoy效果较好，OsO4（1%或0.5%)是Feulgen反应的理想固定剂，只是因OsO4价钱较贵，故一般多采用Carnoy固定液。在Feulgen反应中，不能单独使用Bouin定液，因为它是Feulgen反应的最坏固定剂，但经Aller改进后的Bouin-Aller固定液效果却较好。

3．水解时间：Feulgen反应通常用稀酸进行水解，但水解的时间一定要适当。如水解时间不够, 反应就会变弱；如水解时间过长。或水解地过于剧烈，则脱氧核糖也易掉下来，反应也会减弱。适当的水解时间一般为8~12min。但是水解时间长短也要视标本的类型（如厚薄等)、固定剂的性质以及酸的浓度而定。

4．Schiff试剂的作用：Feulgen反应成功与否的一个非常关键的因素，就是schiff试剂的质量。有一大类试剂均称为碱性品红，它们实际上是由几种产品分别组成的。因此只能选用注明“DNA染色反应用”的碱性品红才行。此外，Schiff试剂的配制方法也可影响DNA的染色反应。

实验八：小鼠腹腔巨噬细胞吞噬现象的观察

【课前预习】

实验前给小鼠腹腔注射台盼兰淀粉肉汤的目的是什么？

【目的要求】

1．了解小鼠腹腔巨噬细胞吞噬现象的原理 2．熟悉细胞吞噬作用的基本过程

【基本原理】

细胞的吞噬作用在单细胞动物是摄取营养物质的方式，在高等动物内的巨噬细胞、单核细胞和中性粒细胞等具有吞噬功能，是机体非特异性免疫功能的重要组成部分。巨噬细胞是由骨髓干细胞分化生成，当病原微生物或其他异物侵入机体时，巨噬细胞由于具有趋化性，便向异物处聚集，巨噬细胞可将之内吞入

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胞质，形成吞噬泡，然后在胞内与溶酶体融合，将异物消化分解。吞噬泡的形成需要有微丝及其结合蛋白的帮助，如果用降解微丝的药物细胞松弛素B处理细胞，则可阻断吞噬泡的形成；免疫抑制剂环磷酰胺（CYP）对巨噬细胞的吞噬作用也有影响。

巨噬细胞起源于骨髓，经血液进入组织中而成，分布于全身各处。当机体受到某些损伤因素时（如微生物或其它病原体或异物侵入），能招引巨噬细胞，同时巨噬细胞有趋化性，主动向病原体或异物游走，在接触到病原体或异物时，细胞膜凹陷伸出伪足包围异物，并发生胞吞作用形成吞噬泡，继而细胞质中的溶酶体与吞噬泡融合，消化分解异物。含台盼蓝的淀粉肉汤，可使腹腔中有较多的吞噬细胞，以供观察吞噬活动。

【实验用品】

1．材料：小白鼠、1%鸡红细胞悬液

2．试剂：6%的淀粉肉汤（含台盼蓝），0.9%生理盐水

3．仪器设备：显微镜、注射器、注射针头、吸管、试管架、解剖刀、解剖镊、载玻片、盖玻片、记号笔

【方法步骤】

1．实验前二天，每天向小鼠腹腔注射6%淀粉肉汤（含台盼兰，起标记作用）1ml以刺激腹腔产生较多的巨噬细胞（此步由教师在实验前进行完毕）。

2．实验时，每组取一只上述处理的小鼠，腹腔注射1% 鸡血悬液0.5~1ml，注射后轻揉小鼠腹部以使红细胞悬液分散均匀。

3．20分钟后，用颈椎脱臼法处死小鼠，迅速剖开小鼠腹部，向腹腔部注射0.5~1ml生理盐水，用吸管轻轻使生理盐水与腹腔液混匀。

4．用吸管抽取腹腔液，滴片，然后盖上盖玻片。 5．镜检 【实验结果】

在高倍镜下可见有许多较大的圆形和形状不规则的巨噬

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