1．维生素B12注射液供试品溶液制备 精密吸取维生素B12注射液样品（100?g/ml）3.0ml，置于10ml 量瓶中，加蒸馏水至刻度，摇匀，得供试品溶液。

2．测定 将样品稀释液装入1cm石英吸收池中，以蒸馏水为空白，在361nm波长处与550nm波长处分别测定吸收度。

五、注意事项

1. 在使用紫外-可见分光光度计前，应熟悉本仪器的结构、功能和操作注意事项。 2. 吸收池的光学面，必须清洁干净，不准用手触摸，只可用擦镜纸擦拭。 六、数据处理

1. 定性鉴别 根据测得的361nm波长处的吸收度与550nm波长处的吸收度数据，计算该两波长处的吸收度比值，并与标准值3.15～3.45相比较，进行维生素B12的鉴别。

2．吸收系数法 将361nm波长处测得的吸收度A值与48.31相乘，即得样品稀释液中每毫升含维生素B12的μg数。

按照百分吸收系数的定义，每100ml含1g维生素B12的溶液（1﹪）在361nm处的吸收度应为207。即：

á1cm（361nm）＝207（100ml/g﹒cm）＝207×10(ml /μg﹒cm )

－4

%C样 ＝ A样/b﹒E11cm ＝ A样×48.31 (μg/ml)

维生素B12标示量（％）＝七、思考题

C样(?g/ml)?样品稀释倍数标示量(100?g/ml)×100％

试比较用标准曲线法及吸收系数法定量的优缺点。

实验18 双波长分光光度法测定安钠咖注射液中

咖啡因的含量

一、目的要求

1．掌握双波长分光光度法测定二元混合物中待测组分含量的原理和方法。 2．掌握选择测定波长（λ1）和参比波长（λ2）的方法。 3．掌握在单波长分光光度计上进行双波长法的测定。 二、实验原理

安钠咖注射液由无水咖啡因和苯甲酸钠组成，其紫外吸收光谱如下：

吸收光谱表明咖啡因的吸收峰在272nm处，苯甲酸钠的吸收峰在230nm处。若测定咖啡因，从光谱上可知干扰组分苯甲酸钠272nm和253nm处的吸收度相等，则

咖?苯咖?苯 △A ＝ A272?Anm253nm

咖苯咖苯＝ A272nm?A272nm?A253nm?A253nm

咖咖苯苯 ＝ A272nm?A253nm(?A272nm?A253nm) 咖咖 ＝ E272nmC咖b?E253nmC咖b

咖咖＝ (E272nm?E253nm)C咖b

＝ ?E咖C咖b

式中：ΔA：混合物在272nm和253nm波长处的吸收度之差。272nm和253nm为干扰组分苯甲酸钠的等吸收波长。

咖咖。 E272nm、E253nm为被测组分在272nm和253nm波长处的吸收系数（用标准品测得）

C咖为被测组分的浓度；b为吸收池厚度。

ΔA仅与咖啡因浓度成正比,而与苯甲酸钠浓度无关，从而测得咖啡因的浓度。 三、仪器与试剂

1．仪器：紫外-可见分光光度计 石英吸收池 量瓶：100ml 吸量管：10ml、1ml

2．试剂：咖啡因、苯甲酸钠、安钠咖

3．试液：安钠咖注射液（每1ml 中含无水咖啡因0.12g、苯甲酸钠0.13g） 四、实验内容与步骤

1．标准贮备液的制备：精密称取咖啡因和苯甲酸钠各0.1g，分别用蒸馏水溶解，定量转移至100ml量瓶中，用蒸馏水稀释至刻度，摇匀，即得浓度为1.0mg/ml的贮备液，置于冰箱中保存。

2．咖啡因标准溶液的制备：精密量取咖啡因贮备液1.0ml，置于100ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀。

3．苯甲酸钠标准溶液的制备：精密量取苯甲酸钠贮备液1.0ml，置于100ml量瓶中，加水稀释至刻度。

4．供试品溶液的制备：精密量取安钠咖注射液（浓度为每1ml中含无水咖啡因0.012g，苯甲酸钠0.013g）1.0ml，置于100ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀。从中精密量取10.0ml，置于100ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀。

5．咖啡因和苯甲酸钠标准溶液紫外吸收光谱的测定：在紫外-可见分光光度计上，分别取咖啡因和苯甲酸钠标准溶液于1cm石英吸收池中，以蒸馏水为空白，在200～400nm范围内，扫描出紫外吸收光谱。

6．干扰组分等吸收波长的选择：从苯甲酸钠吸收光谱图上找出等吸收波长λ其中λ1尽量与咖啡因的最大吸收波长一致。

7．咖啡因标准溶液的△A值测定：在紫外-可见分光光度计上，取咖啡因标准溶液于1cm石英吸收池中，以蒸馏水为空白，在λ1和λ2处分别测其吸收度。

8．安钠咖样品液的△A值测定：在紫外-可见分光光度计上，取安钠咖样品液于1cm石英吸收池中，以蒸馏水为空白，在λ1和λ2处分别测其吸收度。

五、注意事项

1. 在使用紫外-可见分光光度计前，应熟悉本仪器的结构、功能和操作注意事项。 2.在仪器扫描过程中，不要按动任何键，不要任意打开样品室盖子。 六、数据处理

ΔA ＝?ECb

1

和λ2，

?A样?A标??EC样b?EC标b?C样C标

咖啡因标示量% ＝

C样?稀释倍数标示量?100%

咖啡因标示量%应在95%~105%之间。 七、思考题

1．为什么双波长分光光度法可以不经分离直接测定二元混合物中待测组分的含量？ 2．选择等吸收波长的原则是什么？怎样从吸收光谱图上选择等吸收波长？

实验19 导数光谱法测定安钠咖注射液中咖啡因的含量

一、目的

1．学习导数吸收光谱的绘制。

2．利用导数光谱法直接测定二元混合物中组分的含量。

二、提要

1．一阶导数光谱是?A????图谱，??一般在1～4nm之间。

2．当二元组分各自零阶光谱完全重迭时，可选择一组分的一阶导数等于0处波长作为另一组分的测定波长，因导数具加和性，故在此波长下测定混合物的导数值?A??，即为另一组分的导数值。

3．导数值与浓度成正比

??????c?L ????三、仪器与试剂

1．可见—紫外分光光度计：

2．容量瓶： 100ml 3个、250mL1个、50ml6个、500ml1个； 3．刻度吸管；10ml 3支；

4．咖啡因标准液：精密称取咖啡因标准品0.1g，置于100ml容量瓶中用蒸馏水稀释至刻度，再量取此液10ml于100ml容量瓶中用水稀释至刻度；

苯甲酸钠标准液：精密称取苯甲酸钠0.1g,置于100ml容量瓶中，用水稀释至刻度，再精密量取此液5mI于50ml容量瓶中，加水稀释至刻度；

安钠咖注射液样品：每1ml中含无水咖啡因0.12g、苯甲酸钠0.13g,药典规定均应为标示量的93～107.0%。

四、步骤