7、氨基酸标准液 将异亮氨酸、赖氨酸和谷氨酸分别配成的0.2%的水溶液 8、茚三酮试液 0.1%的乙醇溶液。 （四）实验内容和步骤

1、点样 取纸条于下端2.5cm处，用铅笔画一水平线，在线上画出1、2、3、4号四个点，1、2、3号分别用毛细管将三种氨基酸标液个2μL点出约2 mm直径大小的扩散圆点，再在4号点上分别点上三种标液各2μL。

2、展开（上行法） 展开缸内加入展开剂适量，放置至展开剂蒸汽饱和后，再下降悬钩，使色谱纸浸入展开剂约0.5cm，记录开始展开时间。当展开剂前沿上升至15cm左右时，取出色谱纸，画出溶剂前沿，记录展开停止时间，将滤纸晾干或烘干。

3、显色 展开剂晾干活烘干后，用喷雾器在色谱纸上均匀喷上0.1%茚三酮溶液，放入100℃烘箱中烘3~5min，至出现红色斑点为止。 （五）注意事项

1、色谱纸要平整，不得玷污，点样时可在下面垫一张白纸。 2、色谱纸要挂垂直。

3、不要用钢笔和圆珠笔在色谱纸上作剂号。 （六）思考题

1、纸色谱分离氨基酸时，为什么不应使用手直接接触滤纸？ 2、影响Rf值的因素有哪些？

3、色谱展开筒和色谱纸为什么要用张开剂饱和？

实验28 薄层色谱法测定甜叶菊苷含量

(一)目的要求

1、 初步掌握薄层板的制备、点样、展开、显色等一系列操作； 2、 了解薄层色谱的一种定量方法—斑点面积定量法。 (二)实验原理

在选育、种植甜叶菊的过程中及工业上提取、纯化甜叶菊苷的生产中，需要对甜叶菊苷进行定量测定。

甜叶菊苷的分子结构为：

COGlu-GluCH3HCO2-Glu分子量 804.90 熔点 197℃—198℃

由于甜叶菊苷分子量大、熔点高，用气相色谱法测定必须先经过降解，操作麻烦。用薄层色谱法测定，设备简单，换作方便，故在国内普遍采用。

本实验采用斑点面积定量法。根据斑点面积与组分质量的对应关系 ㏒W∽A 式中W 组分质量，单位为μg

A 组分面积，单位为mm2”

以标样的logW为横坐标，A为纵坐标绘制工作曲线，由工作曲线求未知样的含苷量。 (三)仪器及试剂 1、仪器 玻璃板

注射器（或定量毛细管） 10 μL 色谱缸 2、试剂

硅胶 色谱用180一20 0目 羧甲基纤维素

标样 准确称取250 mg甜叶菊苷于25mL容量瓶中，用少量乙醇溶解后，稀释至刻度。 试样 推确称取5g甜叶菊叶子干粉，用45mL乙醇浸泡24小时，过滤于50 mL容量瓶中，用少量乙醇洗滤渣，合并洗出液，滴加乙醇至刻度。

(四)实验内容及步骤

1、配制0.6%羧甲基纤维素(CMC)水溶液 称取0．6g羧甲基纤维素于100 mL蒸馏水中，加热至沸，使羧甲基纤维素溶解。放冷，静置数天，使不溶的羧甲基纤维素沉淀，小心倾出上层清液备用。

2、制备硅胶G板 称取180一200目的色谱用硅胶G6 g，加入13mL羧甲基纤维素溶液，在研钵中研成糊状，用角匙平均分配在二块7×13cm的玻璃板上，涂匀，然后在桌面上轻敲，使表面平滑，再放在校正水平的大玻板上晾干。最后，在110℃烘箱中活化半小时，放干燥器中备用。

3、点样 取一块已制好的硅胶板，在距底边2cm处，用小号打孔器每隔1cm轻轻压一下，再小心把圆圈中的硅胶刮掉。用同一打孔器打下数片圆形小滤纸，再用微量注射器分别吸取标样6、7、8、9、10μL测定样l0μL，点在小滤纸上，待溶剂挥发干后，把滤纸转移到硅胶板的小穴中，使滤纸边缘与小穴周围的硅胶吻接(见图)，为避免滤纸自硅胶板上落下，可用羧甲基纤维素粘接。

4、展开与显色 将点样后的硅胶板小心放入装有15mL展开剂的色谱缸中，待溶剂移行约10 cm后，取出晾干，用碘蒸气显色。

5、测定斑点面积 用铅笔画出斑点的轮廓，再把斑点描在透明纸上，用标准方格纸计算斑点面积。重复(3)一(5)的操作三次，取面积平均值。

（五）结果处理

计算标样质量的对数值logW，和斑点面积A的平方根，以logW为横坐标、A的平方

图 滤纸点样示意图

根为纵坐标绘制工作曲线。

根据试样的斑点面积A，在工作曲线上查得相应的logW, 再计算成叶子中甜叶菊苷的含量。

仪器条件具备时，也可使用薄层扫描仪定量。 （六）思考题

1.薄层色谱斑点面积定量法有什么优点？

2.本实验的误差来源主要在哪里？实验过程应注意什么？

实验29 双波长薄层色谱扫描法测定甲基红含量

(一)目的要求

1、 了解双波长薄层色谱扫描仪的原理、构造、性能和操作，掌握薄层色谱扫描法定 量分析方法；

2、 熟练掌握薄层色谱制板、点样、展开等基本操作。

（二）原理

薄层色谱技术是近年发展起来的一种微量、快速而简单的色谱法。它已广泛应用在分离分析中，尤其适用于小量试样(几十微克到几微克，甚至0.01微克)的分离分析。多年来由于缺乏较满意的检测手段，对薄层色谱法分离后斑点的定量分析，一直未能得到准确的结果，仅能提供半定量的数据。

本实验根据试样中甲基红、甲基橙和甲基黄有不同的极性，在硅胶板上用混合展开剂展开，可将它们分开。然后采用岛津CS—9301型双波长薄层色谱扫描仪，可直接在薄层板上对甲基红斑点进行定量分析，大大提高了测量结果的准确性。 （三）仪器和试剂

1、CS系列双波长薄层色谱扫描仪简介

双波长薄层色谱扫描仪 CS系列双波长薄层色谱扫描仪（CS—9301型或CS—930型）应用了分光光度技术，直接用光密度法测定斑点浓度。由于CS系列双波长薄层色谱扫描仪配有“校正曲线线性化器”和“背景校正”的装置，因此提高了分析的精密度和推确度，消除了吸收光谱法中光密度因浓度的增加而不呈线性的不利因素。此外，CS系列薄层扫描仪与常见光密度法不同之处在于它还备有“双波长法”和“锯齿扫描法”，可消除因基线波动和斑点不规则带来的测量误差。下面对这四种特有的装置和功能分别加以说明。

双波长法 选用双波长时，试样斑点最大吸收波长定为样品波长λs，样品斑点不吸收的波长为参比波长λR。波长的选择必须适当，否则灵敏度低，校正曲线的线性关系受到破坏。采用双波长法，可消除由于薄层板厚度不均匀和薄层板轻微损伤所造成的基线噪音增大，引起基线波动，用两个不同波长的光束来补偿，可得到平滑基线，因此对很小的峰也能测量，从而弥补了单波长法的不足。

锯齿扫描法 斑点在薄层板上展开后，通常不可能总是得到形状相同、大小相等以及浓