（3）烷基化

烷化剂：可将烷基（如甲基）加入到核酸上各种位点的亲电化学试剂。常见的有甲烷磺酸甲酯（MMS）和乙基亚硝基尿（ENU）。

注意：有别于正常甲基化酶的甲基化位点。 （4）聚化加合物 ·紫外线照射可通过DNA链上相邻嘧啶每个碱基的C5双键和C6碳原子环化形成一个环丁烷环从而形成环丁烷嘧啶二聚体。

·一个嘧啶上的C6和其相邻碱基上的C4间生成键后形成另一种嘧啶二聚体6,4-光产物。

·煤焦油中的致癌物苯并芘在肝内由细胞色素P-450代谢后，其中的一种代谢产物可与鸟嘌呤残基共价结合。

·致癌物黄曲霉毒素B1也可与DNA共价结合，导入大块加合物，从而在DNA复制过程中改变遗传信息。

三、DNA修复 1、光复活

在可见光存在的情况下，DNA光复活酶（光解酶）可将环丁烷嘧啶二聚体再分解为单体。

光复活对嘧啶二聚体具有专一性的，修复是无差错的，是损伤被“直接修复”的一种例子。

2、烷基转移酶 3、切除修复

是一种普遍存在的修复机制，可在一系列的损伤中起修复作用，并且这种修复是无差错的。

切除修复有2种形式：核苷酸切除修复（NER）、碱基切除修复（BER）。 4、错配修复

是切除修复的一种特定形式，用于修复在复制中错配并漏过校正检验的任何碱基。

复制错配中的错配碱基存在于子代链中。因此该系统必须在复制叉通过之后有一种能识别亲本链与子代链的方法，以保证只从子代链中去除错配碱基。

在 E. coli中，出现在 GATC 序列中的A常常是甲基化的 ，子链的甲基化在复制完成几分钟后随即进行。所以新合成的DNA是半甲基化的，即亲本链是甲基化的，而子链未被甲基化 ，这样就可以很容易区分它们。

5、重组修复 6、SOS修复 四、重组 1、同源重组

又称“一般重组”，涉及两个DNA分子间同源区域的交换。 2、位点特异性重组

指非同源DNA的特异片段之间的交换，由能识别特异DNA序列的蛋白质所介导，并不需要RecA或ssDNA。

3、转座作用

转座子或转座元件是一些较短的DNA序列，可以转移进细胞基因组中的几乎任何位置。转座作用又称为异常重组（非正常重组），因为它不需要序列间具有同源性，也不是位点特异性的。

IS（insertion sequences，IS）序列是最简单的大肠杆菌转座序列，每个基因组中可能有几个拷贝，其长度在1-2kb之间。

第七章 基因操作

基因工程(gene engineering)

重组DNA(recombinant DNA) 1、对人类遗传信息的认识 2、基因工程药物与疫苗 （1）基因工程疫苗

1986年美国正式批准基因工程乙肝疫苗投放市场（HbsAg） （2）基因工程肽类药物

各种干扰素（interferon，IFN） 生长激素（growth hormone，GH）

超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD） （3）基因工程抗体

美罗华——嵌合抗体（抗CD20） 3、转基因动植物 4、疾病诊断、治疗 一、介绍几个概念 1、DNA克隆（clone）：将相对短的基因组片段或mRNA的DNA拷贝插入自我复制的载体，将形成的重组DNA（recombinant DNA）分子在细菌等宿主生物中大量复制，产生一系列遗传上相同的生物群体，通常称为一个克隆，相应过程称为DNA克隆或重组DNA技术。

2、宿主（host）：可供外援DNA进行复制或表达的宿主细胞，如大肠杆菌、酵母等。

3、载体（vector）：能够自身复制，易与宿主细胞基因组分离，且可插入外源DNA片断的DNA分子，如常用的大肠杆菌克隆载体：质粒载体、噬菌体载体。

4、亚克隆（subcloning）：指将克隆在一个载体中的DNA片段转移至另一个载体的过程。

5、DNA文库（DNA library）： DNA可以是直接从细胞中分离的基因组DNA，也可以是从表达特定基因细胞中提取的mRNA的DNA拷贝（即cDNA），将这些DNA插入到质粒或噬菌体载体中，以获得的重组分子转化细菌或感染细胞，获得的全部克隆称为DNA文库，包括基因组DNA文库和cDNA文库。

二、质粒DNA的制备 1、什么是质粒？

质粒（plasmid）是一种独立与染色体外，能进行自主复制的细胞遗传因子，它能在完整细菌间进行传递，也能在细菌分裂时伴随染色体分配到子代细菌，但它并不是细菌生长繁殖所必须的遗传物质。质粒控制着多种不同的遗传性状，尤其与细菌的抗药性、致病性有关。

2、制备

实验室最常用的方法——碱裂解法

三、DNA限制性内切酶及电泳分析、回收 1、DNA限制性内切酶

·三大技术发明之一，为基因的切割创造了条件。

·本质是细菌的一种抵御外来DNA侵入的原始防御机制。 ·种类繁多，各有特性 ·识别序列

多数限制酶识别4-8bp的回文序列（序列相同，方向相反），如EcoRⅠ限制酶识别6bp回文序列，其切割产物是两条双链片段（称为限制片段），其5’ 端是带有磷酸基的单链突出端，而3’ 端具有游离的羟基。

·酶切条件：温度、离子浓度、pH、酶切时间等 SmaⅠ 30℃ SfiⅡ 50℃ 2、DNA琼脂糖凝胶电泳分析与回收 四、连接、转化、重组子鉴定 1、DNA片断与载体的连接 2、细菌的转化

·感受态细胞（competent cell）：用含钙离子的溶液处理大肠杆菌，使其获得短暂吸收外源DNA的能力，这种状态的细菌称为感受态细胞。

·转化（transformation）：将外源DNA转入细菌细胞的过程。 常用的一些转化方法：CaCl2转化法、电转化法等。 3、重组菌的培养及鉴定 （1）培养

根据载体上的抗性基因，选择合适的培养基。如载体pGEX带有ampr，则可培养基中加入氨苄青霉素。 （2）筛选、鉴定 ·蓝白斑筛选

·限制酶切分析、琼脂糖电泳 ·PCR鉴定 ·探针筛选 ·表达筛选等 4、菌种的保存

·15%的甘油缓冲液 ·冻干保存

第八章 原核细胞基因转录与调节

一、转录的基本原理 （一）概述 基本概念

·RNA聚合酶的功能是复制双链DNA的其中一条链形成RNA ·模板链（反义链）→RNA ·编码链（有义链）

RNA序列与模板链互补与编码链相同

RNA聚合酶催化RNA的合成，当RNA聚合酶与DNA基因的起始端一段特别的区域——启动子结合时，RNA转录便开始了。

·启动子位于起始点即转录成RNA的第一个碱基处周围。从这一点开始，RNA聚合酶沿模板向前移动，同时合成RNA，直到到达结束序列。

·一个转录单元是一段被转录成单链RNA的 DNA序列，它起始于启动子，结束于终止子。

·起始点之前的序列被称为起始点的上游，反之称为下游（转录单元以内）。 为了确切表示编码链，对DNA的序列进行编码，起始点后的第一个碱基编为+1，往下游依次增大，起始点前的第一个碱基为-1，往上游依次减小。

·RNA的合成是在“转录泡”中实现的，在泡中DNA被分开成为两条单链，一条做为模板，当RNA聚合酶沿DNA移动时，转录泡随之移动，RNA链随之增大。

（二）转录的基本过程 1、起始（模板识别）：

（1）RNA聚合酶与双链DNA结合 （2）在启动子部位起始转录

（3） DNA双链解开。解旋从RNA聚合酶结合的启动子部位开始。 （4） 以反义链为模板，在RNA聚合酶的作用下，以rNTP为原料合成RNA。这是从起始位点开始的，被定义为基因序列的+1位置。

2、延伸

·RNA聚合酶向正在增长的RNA链的3’-端共价地添加核糖核苷酸。 ·RNA聚合酶沿5’? 3’方向延伸正在增长的RNA链。

·RNA聚合酶自身沿着反义链（模板）的3’? 5’方向移动。 3、终止

·转录复合物的解体和RNA合成的终止。

·发生在特定的DNA序列处，即终止子。这些序列经常含有一些自身互补区，能在RNA产物上形成 茎环或发夹二级结构。这些结构使聚合酶停顿并随即终止转录。

·在终止反应中，RNA-DNA杂交体分开以重新形成双链DNA，同时RNA聚合酶和新合成的RNA从DNA链上被释放下来。

二、大肠杆菌RNA聚合酶 1、概述

·在E.coli中，仅由一种聚合酶完成全部RNA的转录 ·不需要引物

·以双链DNA为模板 ·5’? 3’

·行使合成RNA的功能时需要Mg2+ 激活

·缺少3’ ? 5’ 外切酶活性,错误率为10-4 ~ 10-5 ·通常为多亚基酶

2、大肠杆菌RNA聚合酶 组成：?2??’??

全酶 = 核心酶 + ?

全酶是转录起始所必需的。但?因子对于转录延伸并不必需，转录起始后就从转录复合物上释放下来。