15．概述分子杂交的概念和应用领域。

解答：在退火条件下，不同来源的DNA互补区形成双链，或DNA单链和RNA单链的互补区形成DNA-RNA杂合双链的过程称分子杂交。通常对天然或人工合成的DNA或RNA片段进行放射性同位素或荧光标记，做成探针，经杂交后，检测放射性同位素或荧光物质的位置，寻找与探针有互补关系的DNA或RNA。直接用探针与菌落或组织细胞中的核酸杂交，因未改变核酸所在的位置，称原位杂交技术。将核酸直接点在膜上，再与探针杂交称点杂交，使用狭缝点样器时，称狭缝印迹杂交。该技术主要用于分析基因拷贝数和转录水平的变化，亦可用于检测病原微生物和生物制品中的核酸污染状况。杂交技术较广泛的应用是将样品DNA切割成大小不等的片段，经凝胶电泳分离后，用杂交技术寻找与探针互补的DNA片段。由于凝胶机械强度差，不适合于杂交过程中较高温度和较长时间的处理，Southern 提出一种方法，将电泳分离的DNA片段从凝胶转移到适当的膜（如硝酸纤维素膜或尼龙膜）上，在进行杂交操作，称Southern印迹法，或Southern杂交技术。随后，Alwine等提出将电泳分离后的变性RNA吸印到适当的膜上再进行分子杂交的技术，被戏称为 Northern印迹法，或Northern杂交。分子杂交广泛用于测定基因拷贝数、基因定位、确定生物的遗传进化关系等。Southern杂交和Northern杂交还可用于研究基因变异，基因重排，DNA多态性分析和疾病诊断。杂交技术和PCR技术的结合，使检出含量极少的DNA成为可能。促进了杂交技术在分子生物学和医学领域的广泛应用。DNA芯片技术也是以核酸的分子杂交为基础的。

16．概述核酸序列测定的方法和应用领域。

解答：DNA的序列测定目前多采用Sanger提出的链终止法，和Gilbert提出的化学法。其中链终止法经不断改进，使用日益广泛。链终止法测序的技术基础主要有：① 用凝胶电泳分离DNA单链片段时，小片段移动，大片段移动慢，用适当的方法可分离分子大小仅差一个核苷酸的DNA片段。② 用合适的聚合酶可以在试管内合成单链DNA模板的互补链。反应体系中除单链模板外，还应包括合适的引物，4种脱氧核苷三磷酸和若干种适量的无机离子。如果在4个试管中分别进行合成反应，每个试管的反应体系能在一种核苷酸处随机中断链的合成，就可以得到4套分子大小不等的片段，如新合成的片段序列为-CCATCGTTGA-，在A处随机中断链的合成，可得到-CCA和-CCATCGTA两种片段，在G处中断合成可得到-CCATCG和-CCATCGTTG两种片段。在C和T处中断又可以得到相应的2套片段。用同位素或荧光物质标记这4套新合成的链，在凝胶中置于4个泳道中电泳，检测这4套片段的位置，即可直接读出核苷酸的序列。 在特定碱基处中断新链合成最有效的办法，是在上述4个试管中按一定比例分别加入一种相应的2?,3?-双脱氧核苷三磷酸（ddNTP），由于ddNTP的3?位无-OH，不可能形成磷酸二酯键，故合成自然中断。如上述在A处中断的试管内，既有dATP，又有少量的ddATP，新合成的-CCA链中的A如果是ddAMP,则链的合成中断，如果是dAMP，则链仍可延伸。因此，链中有几个A，就能得到几种大小不等的以A为末端的片段。如果用放射性同位素标记新合成的链，则4个试管中新合成的链在凝胶的4个泳道电泳后，经放射自显

影可检测带子的位置，由带子的位置可以直接读出核苷酸的序列。采用T7测序酶时，一次可读出400多个核苷酸的序列。近年采用4种射波长不同的荧光物质分别标记4种不同的双脱氧核苷酸，终止反应后4管反应物可在同一泳道电泳，用激光扫描收集电泳信号，经计算机处理 可将序列直接打印出来。采用毛细管电泳法测序时，这种技术一次可测定700个左右核苷酸的序列，一台仪器可以有几十根毛细管同时进行测序，且电泳时间大大缩短，自动测序技术的进步加快了核酸测序的步伐，现已完成了包括人类在内的几十个物种的基因组测序。

RNA序列测定最早采用的是类似蛋白质序列测定的片段重叠法，Holley用此法测定酵母丙氨酸tRNA序列耗时达数年之久。随后发展了与DNA测序类似的直读法，但仍不如DNA测序容易，因此，常将RNA反转录成互补DNA（cDNA），测定cDNA序列后推断RNA的序列，目前16S rRNA 1 542 b的全序列测定，23S rRNA 2 904 b的全序列测定，噬菌体MS2 RNA 3 569 b的全序列测定均已完成。

4 糖类的结构与功能

1．书写?-D-吡喃葡萄糖，L- (-)葡萄糖，?-D- (+)吡喃葡萄糖的结构式，并说明D、 L；+、-；?、?各符号代表的意义。

解答：书写单糖的结构常用D、L；d 或(+)、l或(-)；?、?表示。D-、L-是人为规定的单糖的构型。是以D-、L-甘油醛为参照物,以距醛基最远的不对称碳原子为准, 羟基在左面的为L构型, 羟基在右的为D构型。单糖由于具有不对称碳原子,可使平面偏振光的偏振面发生一定角度的旋转，这种性质称为旋光性。其旋转角度称为旋光度,偏振面向左旋转称为左旋,向右则称为右旋。d 或(+)表示单糖的右旋光性,l或(-)表示单糖的左旋光性。 2．写出下列糖的结构式：?-D-葡萄糖-1-磷酸，2-脱氧-?-D-呋喃核糖，?-D-呋喃果糖，D-甘油醛-3-磷酸，蔗糖，葡萄糖醛酸。 解答：略。

3．已知某双糖能使本尼地(Benedict)试剂中的Cu2+氧化成Cu2O的砖红色沉淀,用?-葡糖糖苷酶可将其水解为两分子?-D-吡喃葡糖糖,将此双糖甲基化后再水解将得到2,3,4,6-四氧甲基-D-吡喃葡糖糖和1,2,3,6-四氧甲基-D-吡喃葡糖糖,试写出此双糖的名称和结构式。

解答：蔗糖双糖能使本尼地(Benedict)试剂中的Cu2+氧化成Cu2O的砖红色沉淀,说明该双糖具还原性，含有半缩醛羟基。用β―葡糖苷酶可将其水解为两分子β-D-吡喃葡糖, 说明该双糖是由β-糖苷键构成的。将此双糖甲基化后再水解将得到2,3,4,6-四氧甲基-D-吡喃葡糖糖和1,2,3,6-四氧甲基-D-吡喃葡糖, 糖基上只有自由羟基才能被甲基化，说明β-葡糖(1→4)葡糖构成的为纤维二糖。

4．根据下列单糖和单糖衍生物的结构：

CH2OHCHOHHCCCOHOHOHCHOHCOHHOHHCCCHOHOHCHOCHOHCNHCOCH3HOCHHOHOHCCCHHOHHHHOCCCOHOHHCH2OH

(A) (B) (C) (D)

CH2OH CH2OH

CH2OH(1)写出其构型(D或L)和名称；(2)指出它们能否还原本尼地试剂；(3) 指出哪些能发生成苷反应。

解答：(1) 构型是以D-,L-甘油醛为参照物,以距醛基最远的不对称碳原子为准, 羟基在左面的为L构型, 羟基在右的为D构型。A、B、C为D构型，D为L构型。

(2) B、C、D均有醛基具还原性，可还原本尼地试剂。A为酮糖，无还原性。 (3) 单糖的半缩醛上羟基与非糖物质(醇、酚等)的羟基形成的缩醛结构称为糖苷, B,C,D均能发生成苷反应。

5．透明质酸是细胞基质的主要成分，是一种黏性的多糖,分子量可达100?000，由两单糖衍生物的重复单位构成,请指出该重复单位中两组分的结构名称和糖苷键的结构类型。

解答：透明质酸的两个重复单位是由β―D―葡萄糖醛酸和N-乙酰氨基葡萄糖通过β-1,3糖苷键连接而成。

6．纤维素和淀粉都是由1→4糖苷键连接的D―葡萄糖聚合物，相对分子质量也相当，但它们在物理性质上有很大的不同，请问是什么结构特点造成它们在物理性质上的如此差别? 解释它们各自性质的生物学优点。

解答：淀粉是葡萄糖聚合物，既有α→1，4 糖苷键，也有α→1，6糖苷键，为多分支结构。直链淀粉分子的空间构象是卷曲成螺旋形的,每一回转为6个葡萄糖基,淀粉在水溶液中混悬时就形成这种螺旋圈。支链淀粉分子中除有α-(1,4)糖苷键的糖链外,还有α-(1,6)糖苷键连接的分支处,每一分支平均约含20～30个葡萄糖基,各分支也都是卷曲成螺旋。螺旋构象是碘显色反应的必要条件。碘分子进入淀粉螺旋圈内，糖游离羟基成为电子供体，碘分子成为电子受体，形成淀粉碘络合物，呈现颜色。其颜色与糖链的长度有关。当链长小于6个葡萄糖基时,不能形成一个螺旋圈,因而不能呈色。当平均长度为20个葡萄糖基时呈红色,红糊精、无色糊精也因而得名。大于60个葡萄糖基的直链淀粉呈蓝色。支链淀粉相对分子质量虽大，但分支单位的长度只有 20～30个葡萄糖基,故与碘反应呈紫红色。纤维素虽然也是由D-吡喃葡萄糖基构成，但它是以β-(1,4)糖苷键连接的一种没有分支的线性分子，它不卷曲成螺旋。纤维素分子的链与链间，能以众多氢键像麻绳样拧在一起，构成坚硬的不溶于水的纤维状高分子（也称纤维素微晶束），构成植物的细胞壁。人和哺乳动物体内没有纤维素酶(cellulase),因此不能将纤维素水解成葡萄糖。虽然纤维素不能作为人类的营养物,但人类食品中必须含纤维素。因为它可以促进胃肠蠕动、促进消化和排便。

7．说明下列糖所含单糖的种类、糖苷键的类型及有无还原性? （1）纤维二糖 （2）麦芽糖