美国药典会议官方制订 通则： <621> 色谱法

5. 按各论进行分析。

色谱柱

用于USP-NF检测中的填料（L）、相（G）、载体（S）的完整清单位于试剂、指示剂、溶液 部分中的色谱试剂 项下。此清单是为了方便色谱操作者参考，以识别在具体各论中规定的相关色谱试剂。

色谱相关定义和解释

色谱图：一张色谱图是用图示的形式展现了检测器的响应、流出物中的待分析物的浓度或用以定量测定流出物浓度或与之相对应的流出体积或时间。在平面色谱法中，色谱图参考纸或薄层的不同区域。

图一.两种物质的分离色谱图

图1代表了两种物质（物质1和2）的典型色谱分离，其中t1和t2是各自的保留时间，h、

h/2、和Wh/2分别是峰1的峰高、半峰高、半峰宽。W1和W2分别是峰1和2的峰宽。各空气峰是气相色谱图的一个特征，就像在液相色谱法中的前面的溶剂峰一样。这些未保留组分的保留时间间被指定为tM。

滞后体积(D)：（也作梯度延迟体积）指洗脱物出现的点到柱头这一段的体积。

死时间 (tM)：死时间指不被固定相吸附的组分洗脱出来所需的时间（见图1，以空气峰或不吸附物峰的形式，在基线上以min为单位）。

死体积 (VM)：死体积指不被固定相吸附的组分洗脱出来所需的流动相的体积。它可以由死时间和流速来计算，以mm/min为单位：

VM = tM × F

在分子排阻色谱法中，用符号V0 表示。

理论塔板数 (N)1: 理论塔板数N是柱效的衡量方法。对于高斯峰，通过此公式来计算：

N=16(tR/W)2

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其中，tR是该物质的保留时间，而W是此峰在其基线处的峰宽，由该峰对于基线相对延伸的直线而获得。N的数值取决于待色谱分析的物质以及操作条件，例如流动相或载气流速和温度、填料的性质、填料在色谱柱内的均匀程度，以及对于毛细管柱，固定相薄膜的厚度、色谱柱的内径和长度。

当使用了电子积分仪时，它可能以此方程式方便的测定理论塔板数：

N=5.54(tR/Wh/2)2

其中，Wh/2是半峰高处的峰宽度，直接得自电子积分仪。但是，当有争议时，将只使用基于基线处的峰宽度的方程式。

峰：当一种组分从色谱柱中洗脱出来时检测器产生的响应的部分色谱记录。若分离不完全，两种或多种成分可能会洗脱产生一个未分离的色谱峰。

峰谷比（p/v）：峰谷比用于当分离两峰的基线无法得到时，作为在相关物质的测定时的系统适用性参数，图2代表了两物质部分分离，其中Hp是小峰距离基线的高度，Hv是大峰和小峰分离的最低点距离基线的高度：

p/v=Hp/Hv

图2 峰谷比

相对比移值（Rret）: 相对比移值是同一时间内待分析物移动的距离和参照物移动的距离之比，通常用于平面色谱法中。

Rret = b/c

相对保留值（r）：一种组分和作为参照的另一种组分在特定条件下的调整保留时间之比：

r = tR2-tM/tR1-tM

其中tR2是待测物从进样起的保留时间；tR1是参照物从进样起的保留时间；tM是过程中不被吸附的物质的保留时间，所有值均在同一色谱柱相同实验条件下所得。

相对保留时间（RRT）：作不可调节的相对保留值。在美国药典中，通常以不可调节的相对保留值来作对比，除非有特别的规定。

RRT=tR2/ tR1

符号rG也用于指定不可调节的相对保留值。

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相对标准偏差:

比移值 (RF): 比移值是平面色谱中于从原点到区域中心的距离除以从原点到流动相的的距离的比值。见图3：

RF = b/a

流动相前沿 样品斑 参考斑

起始点（线）

图3 薄层色谱典型图示

保留因子(k) : 保留因子也作容量因子（k’），定义为：

k = 流动相中物质的量/ 定相中物质的量

或

k = 间流动相中物质的洗脱时间/ 相中物质的洗脱时间

一种组分的容量因子可由色谱图来计算：

k=( tR- tM )/ tM

保留时间（tR）：在液相色谱和气象色谱中，保留时间tR定义为样品从进样到洗脱区域出现最大峰响应的时间。tR可用作物质鉴别的参数。色谱保留时间是它们所代表的物质的特征，但是并非独一无二。供试物质与标准物质保留时间重合可以用作鉴别概况中的一个特征，但是仅此不足以确立其鉴别。有些物质的绝对保留时间在每个色谱图上都不相同。

保留体积（VR）：保留体积是洗脱一种组分所用的流动相的体积。它可以通过保留时间和流速进行计算，mL/min:

VR=tR×F

分离度(Rs): 某个混合物中两种组分的分离，是由以下公式决定的：

Rs=2(tR2-tR1)/(W1-W2)

其中，tR2和tR1是此两种组分的保留时间，而W2和W1则是通过这些峰对于基线的相对延

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伸线而获得的在峰底的对应宽度。

当使用了电子积分仪时，它可能以此方程式方便的测定分离度:

RS = 1.18(tR2–tR1)/(W1,h/2+ W2,h/2)

分离因子(α)：分离因子由毗邻的两个峰的相对保留进行计算（分离因子的值通常大于1）

α= k2 / k1

对称因子(As)：峰的对称因子（也作拖尾因子）可以通过以下公式进行计算（见图4）：

As =W0.05 /2f

其中W0.05是5%峰高处的峰宽，f是最大峰到峰起始边缘的距离，此距离在离基线5%的峰高处测量。

图4 不对称色谱峰

拖尾因子：见对称因子

系统适用性

系统适用性测试是气相和液相色谱法的一个不可分割的部分。它们用于证实色谱系统对于将要进行的分析是充分适用的。

这些测试基于这样的概念，设备、电子仪器、分析操作和待分析样品构成了一个完整的系统，而可以作为整体来评估。

分离度Rs（注意：所有术语和符号均在符号术语表中做了定义）是柱效N的函数，并被规定范围以便确保临近的洗脱物质彼此分离，从而确立该系统的常规分离效力，并且确保内标物质与药物分离。柱效也可以规定为一项系统适用性要求，特别是当色谱图上只有一个被关注的峰时；但是，与直接测量相比，以此方法确保分离度，是一个可靠性较低的方式。柱效是一个峰陡峭度的指标，其对于痕量组分的检测是非常重要的。

标准溶液制备品或其他标准溶液重复进样可用于比较以证实精密度是否达到要求。除非在各论中另有规定，如果对于相对标准偏差的要求为2.0%或更小，要用来自五次分析物重复进样的数据计算相对标准偏差RSD%；如果相对标准偏差的要求大于2.0%，则需使用六次重复进样的数据。

对于各论中纯物质的量为100%的药物的含量测试中，无最大相对标准偏差，允许的最大标