生物仪器在我的科学研究中的应用

刘硕 2010212160001

生物信息学现在发展迅速，而基因组学和蛋白质组学的研究是生物信息学中的一个重要组成部分。20世纪90年代初,生物学家提出并开始实施了人类基因组计划(HGP),由于基因组计划的飞速发展使提早完成而进入\后基因组时代\，从而基因组学、蛋白质组学、信息组学等一系列组学悄然兴起。生命科学的研究重心转移到对功能基因组学的研究,其中的蛋白质组学(Proteomics)更是研究热点之一。蛋白质组(Proteome)是由澳大利亚博士Marc Wilkins在1994年首先提出.它是指一个细胞或组织所包含的所有蛋白质,现在把它定义为基因组表达的全部蛋白质. 作为一个新的研究领域，蛋白质组学发展的关键是近年来质谱技术的革新。这种革新极大地促进了质谱技术在生命科学研究中的应用。80年代末，随着两种崭新的尤其适合蛋白质研究的软电离方式ESI（电喷雾电离）和MALDI（基质辅助激光解吸附电离）的出现，质谱成为现代蛋白质科学中最重要和不可缺少的组成部分。而质谱技术的重要进展使得通过酶解、质量分析、序列分析及其数据库检索对蛋白质进行高通量快速鉴定的技术方法应运而生，并成为\后基因组时代\的关键核心技术。 1. 生物质谱技术以及分类

质谱技术是目前在鉴定蛋白质的多种方法中发展最快、最具潜力的技术,具有高灵敏度、高准确度、自动化等特点,近10年来,其灵敏度更是提高了1000多倍。它的原理是使样品分子离子化后,根据不同离子间的质核比（ｍ/ｚ)的差异来分离并确定其相对分子质量。 伴随电喷雾电离(ESI)和基质辅助激光解吸电离(MALDI)两项具有划时代的“软电离”技术的出现，各种新质谱技术不断涌现。 1.1 电喷雾电离技术

电喷雾电离（ESI）是将蛋白质的弱酸性水溶剂或溶液通过毛细管导人大气压电离源内，在气化气的帮助下及源内毛细管终端和反电极之间的强电场作用下，样品溶液电离，生成的气相离子经质量分析器分析，测出它们的质荷比，用一简单的方程式，能精确测出蛋白质的分子量，质量准确度达0.01%或更好。尽管ESI允许使用少量缓冲液、盐和去垢剂，但这些物质可能与待测物形成加合物，导致产生难以指认的分子量或抑制待测物离子的形成。因而最佳的离子形成是在无缓冲液、无盐和去垢剂的情况下。ESI是以连续离子化方式使样本电离,可应用于飞行时间质谱(TOF)、离子肼质谱(ITMS)等。同时可与高效液相色谱(HPLC)、毛细管电泳(CE)等技术结合起来。2-DE分离的蛋白质点,经酶解后,生成的肽混合物不需分离,可直接导入带有ESI的串联质谱(MS/MS)分析仪中(如HPLC-MS/MS、CE-MS/MS、LC-MS/MS),

目前均已初步实现自动化。

1.2 基质辅助激光解吸电离技术

MALDI是以脉冲离子化方式使样品电离，它常与飞行时间质谱(TOF—MS)联用，称为基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)。MALDI-TOF-MS技术采用固相进样，样品蛋白质在检测前通过还原、烷基化、酶解、脱盐后以一定比例与基质混合，点样于点样板上，在空气中自然干燥后置于质谱仪上，用一定波长的激光打在样品上，使样品离子化，然后在电场力作用下飞行，通过检测离子的飞行时间(time of flying, TOF)计算出其质量电荷比，从而得到一系列酶解肽段的分子量或部分肽序列等数据，最后通过相应的数据库搜索来鉴定蛋白质。为了提高检测精确度，研制出了反射飞行时间质谱和延迟飞行时间质谱。由于能耐受较高浓度的缓冲溶液、盐和去垢剂，方法简便、快速、灵敏度高、质量范围广、结果准确、质量精度、自动化程度高等特点，使之应用广泛。 1.3 杂交质谱技术

杂交质谱仪是在液相色谱—电喷雾—三级四极串联质谱仪的基础上，采用飞行时间质量分析器代替最后一个四极杆质量分析器，形成液相色谱—电喷雾—四极杆飞行时间串联质谱仪(称Q-TOF或QQ-TOF)，从而大大提高了仪器的分辨率、灵敏度和质量分析范围。它与MALDI-TOF-MS一起，已成为生命科学研究中强有力的分析技术和手段。 1.4 MALDI-TOF-TOF-MS

这是新型的生物质谱技术，和单级的MALDI-TOF相比，精度更高，信息量更广。目前是蛋白质组研究中最有力的工具。 1.5 LC-ESI-MS

液相色谱／电喷雾质谱（LC／ESI／MS）液相色谱可以起到脱盐和浓缩样品的作用，减少盐或其它小分子对样品离子化的影响而降低样品的损耗和污染．液相色谱与质谱在线联用使质谱法与常规的蛋白质分析方法可以很好的联用．其精确度和灵敏度都大大超过了常规方法．并且，快速流动的在线分离技术是一种高效率的生物分析方法。事实证明，用LC-ESI-MS进行生物大分子的分析鉴定获得了满意的结果。 2. 质谱在蛋白质组学研究中的应用

我现在做蛋白质组方面的生物信息研究学习，所以质谱在这方面有着很重要的应用。

质谱用于2-DE分离的蛋白质的鉴定主要通过多肽、蛋白质的质量鉴定、肽指纹谱(Peptide massfingerprint, PMF)测定以及氨基酸序列测定等方法来完成，其中以MALDI-TOF-MS的PMF测定与ESI- MS/MS或HPLC-ESI-MS/MS所进行的序列测定为目前采用

最多的两种方法。除此之外，质谱还可用于对蛋白质磷酸化定位;在糖蛋白鉴定和分析中有重要作用;对抗原决定部位的确认;甚至在对蛋白质和蛋白质、低聚核苷酸及金属间的相互作用的分析等方面都是重要的应用。 2.1 用于分子质量的检测

目前常规应用于测定蛋白质分子质量的方法，例如凝胶电泳法、高效凝胶色谱法或超速离心法，不但样品用量较多，操作较繁且误差大(误差为10％)，使蛋白质分子质量的估计不可靠。新的质谱电离技术，尤其是电喷雾电离质谱(ESI-MS)和基质辅助激光解吸电离质谱(MALDI-MS)，测定分子量的准确度高达0．1％～0．001％，这是目前任何其它技术都未能达到的。ESI-MS可用来准确地和高灵敏地确定多肽与蛋白质的分子质量。ESI-MS在测定时蛋白质分子都高度质子化，在仪器有限的m／z范围内仍能测定相当大的蛋白质分子(高达400000Da)。MALDI技术在测定蛋白质、多肽分子质量时比ESI更优越，测定的分子量更大，可高达980000Da。预计在今后相当长的时期内蛋白质、多肽分子质质量的准确测定仍将是生物质谱的一个重要应用。 2.2 用于肽指纹谱测定

肽指纹谱分析指的是组成分析，它的对象是单个的纯化后的肽或蛋白，其目的在于测定它们的一级结构、蛋白修饰或鉴别遗传差异等。MALDI-TOF是一种最有效的鉴定技术,它可通过肽指纹图谱（PMF）来鉴定蛋白质。用这种技术检测胰酶酶切后的肽质量数有很高的准确度（达到100ppM或更高）,可与理论上预测的胰酶对蛋白酶切后所形成的一系列肽质量数比较（数据库查询）。

肽指纹谱的测定是对2-DE分离的蛋白质点采用蛋白酶解或化学降解，对所得多肽混合物进行质谱分析。最常采用的方法有两个：一是对2-DE分离的蛋白斑点进行胶上原位酶解，提取、收集酶解产物(必要时做适当的脱盐或浓缩处理)，做质谱分析。另一种是对2-DE分离的蛋白质转印到偶合了蛋白酶的PVDF膜上，直接进行质谱分析。由于不同的蛋白质具有不同的氨基酸序列，因而不同蛋白质所得肽片具有指纹的特征。

由于MALDI所具有的高灵敏度以及它对盐和去垢剂的耐受性，在肽指纹谱的鉴定中，对于蛋白质组研究样品中的大量蛋白而言，常采用MALDI-TOF-MS为基础，进行高通量的蛋白和多肽质谱指纹分析。ESI-MS也可在很短的时间内得到蛋白质酶解后的肽指纹谱，ESI-MS的优点是在肽谱图中能够得到Mr低于400um的小分子肽段。因此，它可以鉴定一些在其它质量肽谱图中不能区分的肽谱，另外，它可和HPLC系统直接相连来分析酶解后的碎片不需任何纯化。 2.3 肽序列测定

肽序列信息一般用串联质谱(MS/MS)测得。液相分离的肽段经在线连接的电喷雾质谱仪检测,质谱仪可选取肽段母离子并打碎并行成碎片离子,质量分析器测得碎片离子的质量,即得MS/MS质谱图,根据MS/MS图谱中不同碎片的质量差,可推测被测肽段的序列。然后利用一些相应的软件去序列信息库查找并鉴定蛋白质。ESI-MS所产生的多电荷离子特别适用于串联质谱分析，在质量肽谱中应用ESI-MS可提供一种快速证实蛋白质和多肽序列信息的方法。最新发展的超高灵敏度的纳升电喷雾串联质谱技术是一种用于SDS-PAGE分离的蛋白质进行测序的简便有效的方法，用此方法低至5ng的蛋白质都可被测序。由于此质谱技术产生的液滴比普通电喷雾质谱产生的液滴小100倍，因而可在最小的样品消耗量下获得最大灵敏度，灵敏度可高达fmol，此种方法特别适用于微量样品的质谱分析。 2.4 在其他方面的应用

MALDI-MS和ESI-MS被广泛应用于生物样品如多肽、蛋白质及核酸的分析，由于这种具有软电离方式的质谱具有极高的灵敏度及准确度，目前也被成功地用于糖蛋白的结构分析，与普通的化学方法相比，质谱法快速、简单，结合网上数据库检索、凝集素亲和提取、二维凝胶电泳以及靶上直接酶切等新方法，可以提供糖蛋白的一级结构乃至高级结构的信息。 3. 未来的发展

随着生物质谱技术在通量化、灵敏度、分辨率和准确度上的不断改进，将会满足大规模、高通量和自动化筛选蛋白质的需求，从而在蛋白质水平上测得完整的基因表达，在细胞、组织、生命机体的交互系统、代谢路径等方面，给人们提供一个更为精密、难确的信息，这将促进未来生命科学的整体发展。但也要清醒地看到，当前生物质谱技术在对低丰度蛋白质的检出能力，以及质谱数据的软件分析与综合上仍存在不足，这点对于我们在后期的数据分析上带来了一定的困难，今后希望能更好的结合生物信息学得到改善。生物质谱技术在蛋白质组学中的应用仍需要蛋白质化学修饰及同位素标记技术的发展。精度更高的质谱技术也应该会很快在蛋白质组研究中得到广泛应用。