杜仲法尼烯基焦磷酸合酶基因cDNA全长的克隆与序列分析

摘 要：采用RT-PCR法，从杜仲幼嫩叶片中分离法尼烯基焦磷酸基因cDNA全长序列，克隆并对该基因全长序列进行生物信息学分析。从杜仲嫩叶中共获得两个基因分别命名为EuFPPs1和EuFPPs2，测序结果表明两基因开放阅读框分别为1047bp和1029bp，推测分别可以编码348个和342个氨基酸残基，在线预测表明两个蛋白序列均存在两个聚丙烯合酶位点。系统进化分析结果表明，EuFPPs1和EuFPPs2分别聚集于不同的分支，它们之间的进化距离为0.352，但是在亲缘关系上均与楤木和人参最近，进化距离分别为0.281、0.287，0.175，0.184。关键词：杜仲；FPPs；基因克隆；序列分析：生物信息学文献标识码：A

试剂：总RNA提取试剂RNAiso Plus、反转录酶、Taq聚合酶、DNA marker、载体pMD○R 19-T均购自宝生物工程（大连）有限公司（TaKaRa）；克隆宿主菌体大肠杆菌JM109由上海生工提供，引物均由上海生工合成。实验材料：采自本实验室周同的杜仲嫩叶。1.2总RNA提取及cDNA合成剪取杜仲幼嫩枝条，置于装有干冰的泡沫盒中，立即运回实验室提取叶片总RNA。快速称取约100mg杜仲幼嫩叶片，置于液氮预冷的研钵中，倒入少量液氮，迅速研磨成粉，并边研磨边添加液氮。采用TaKaRa公司提供的Trizol试剂，并按试剂所提供的策略经过改良提取总RNA[7]。采用1%的琼脂糖凝胶电泳检测RNA的质量，并用分光光度汁检测RNA浓度。利用TaKaRa公司的PrimeScript反转录酶试剂盒，试剂盒所提供的方法将所提取的总RNA反转录为第一链互补链DNA（cDNA）。1.3杜仲FPPs基因PCR扩增纯化及克隆

从NCBI上搜索FPPs基因序列，根据对高度相似序列的分析设计特异引物，见表1。以cDNA为模板，并以无菌水为模板做阴性对照，按照以下体系对杜仲FPPs基因进行扩增：10×Ex buffer5.0μL，dNTP（2.5mmol/L each）4.0μL，Primer（F）1.0μL，primer（R）1.0μL，Ex Taq 0.25μL，cDNA4.0μL，补加ddH2O至终体积50.0μL；PCR扩增程序如下：94℃预变性5min；30个循环：94℃变性30s。52℃退火30s，72℃延伸1min；72℃延伸10min，4℃保存。利用TaKaRa公司的Agarose Gel DNA Fragment Recovery Kit Vei.2.0对PCR产物进行割胶纯化，割胶纯化后电泳检测纯化DNA的质量，并用紫外分光光度计检测其浓度。采用TaKaRa公司提供的载体pMD○R19-T，并按其提供的方法将纯化产物连接到载体上，转化由氯化钙法制备的JM 109感受太细胞，在氨苄抗性平板上进行蓝白筛选，挑取菌落经过PCR检测后选择阳性克隆，培养阳性克隆提取质粒送TaKaRa公司测序，测序仪为AB1公司的3730测序仪。1.4杜仲FPPs基因的cDNA序列的信息学分析FPPs基因编码蛋白的理化性质预测采用ExPASy Proteomics Server提供的在线工具Protparam；FPPs基因可表达的蛋白质结构搜索分别采用在线工具ExPASy PROSITE（http：//www.expasy.ch/prosite/）和NCBI在线工具（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi/）。蛋白质二级结构分析和结构域的三维建模采用SWISS-MODEL （http：//swissmodel.espasy.org/）。 采用SignalP4.0 Server （http：//www.cbs，dtu.dk/servers/sigalP/）进行分泌蛋白预测[8]；利用WOLF PSORT（http：//wolfpsort.org/）进行蛋白定位信号预测；采用在线软件HMMTOP（http：//www.enzim.hu/hmmtop/）对蛋白进行跨膜区域预测；通