（1）经大规模PCR扩增获得独立cDNA片段；

（2）用机械手将PCR产物点在合适的介质上，变性、固定； （3）分别从不同器官、组织或细胞中分离mRNA，反转录生成cDNA； （4）用不同的荧光染料标记不同的cDNA样本； （5）将标记后的cDNA与点好的芯片进行杂交； （6）激光扫描芯片杂交结果，计算机处理； （7）分析杂交数据。

6. 4. 3 基因芯片数据分析

基因芯片数据分析包括两部分，数据可靠性分析和生物学意义分析。 数据可靠性分析。因为用基因芯片进行杂交分析，每次实验结果都会有些变化，因为包括靶DNA浓度、探针浓度、杂交双方的序列组成、盐浓度以及温度等许多因素影响了杂合双链的形成和稳定性。因此，需要进行重复试验以确保数据的准确。主要的方法是通过两次平行杂交反应，将每个基因在两个反应中的表达水平做成对应散点图，只要绝大多数基因的杂交结果都在45度斜线附近，就说明实验结果是可靠的（图6-35）。

为了保证基因芯片数据的可靠性，芯片中还需要加上多个持家基因（housekeeping genes）作为内对照。持家基因，如呼吸作用的酶类和细胞骨架蛋白基因等，是维持细胞正常生长发育的必须基因，其表达水平在细胞内基本不变。数据处理时，认为持家基因的反应信号在两种组织中不变，依此确定其它基因表达信号的相对变化。

生物学意义分析。主要指通过分析芯片杂交数据，研究差异表达基因的生物学意义。通常，在芯片中某一器官或发育时期可能有成百上千个差异表达基因。例如，基因芯片分析植物根部可能有400多个特异表达的基因，如果要将这些基因的来龙去脉都搞清楚，可能要追溯超过4000篇以上的文献（假设1个基因需要查阅10篇文献）。这种不捡重点的方法耗时耗力，所获得的结果也往往不一定有意义。因此，首先将差异表达基因定位于不同的生化代谢途径，统计每条生化代谢途径中固有的基因数量和被基因芯片定位的差异表达的基因数量，可以计算出

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特定器官或特定发育阶段表达有显著差异的代谢途径。

图6-36是11,832个棉花cDNA的玻璃芯片杂交图谱的差异表达基因聚类分析，发现有超过700个基因在棉花纤维伸长期特异性高表达。将这些基因定位到不同代谢途径中并经过统计分析发现，乙烯合成、细胞骨架和脂肪酸合成及延伸是三个在纤维细胞中特异性表达的代谢途径（表6-4）。在后续生物学研究中，以这些最具代表性的代谢途径为突破口，阐述了这些途径在纤维细胞发育中的重要性。

表6-4 用途径分析法研究基因芯片数据中可能具有生物学意义的代谢途径 生物体代谢途径

芯片中被定位的基因数

总数 乙烯合成 细胞骨架

脂肪酸合成及延伸 糖胺降解 抗坏血酸代谢 油菜素内脂合成

6. 5 利用酵母鉴定靶基因功能

酿酒酵母作为单细胞真核生物，具有和动植物细胞相似的结构特征，包括细胞核，内质网，高尔基体，线粒体，过氧化物酶体，细胞骨架等，而且其细胞生长发育过程和动植物细胞也有很高的相似性，很多基因在酵母和动植物细胞中是高度保守的。而且，酵母细胞很容易进行生物化学和分子生物学操作，因此，酵母是基因功能研究中常用的模式生物。

6. 5. 1 酵母的遗传学和分子生物学简介

酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）有稳定的单倍体和二倍体细胞，是最早完成基因组DNA全序列测定的真核生物。鉴于其快速生长能力、无性繁殖能

2914 5 75 64 16 63 6

定位的差异 表达基因数

162 3 10 9 4 8 2

0.0016 0.0077 0.0080 0.0099 0.0217 0.0397

0.0295 0.0376 0.0376 0.0376 0.0522 0.0629

P值

Q值

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力以及简便的平板影印能力，它是生命科学领域里广泛应用的模式生物之一。理论上，与任何一种遗传学特征相对应的不同物种的结构基因都可以通过质粒文库的互补作用而在酵母缺失突变体中得到鉴定。导入酵母细胞中的DNA既能以自主复制的形式存在，也可能以被整合到基因组的方式存在。酵母中转化DNA的整合重组主要通过同源重组方式进行，整合效率较高。

酵母细胞的直径大约有5 μM,在光学显微镜下可以观察它的许多重要特征。酿酒酵母细胞是以出芽方式生长的。出芽的细胞被称为母细胞，产生的芽就成为子细胞（图6-37）。新生的芽从酵母细胞分裂周期一开始就出现，直到细胞周期结束才从母细胞上分离下来。由于酵母细胞的全部生长都集中在芽上，而且这种生长贯穿整个细胞周期，所以通过观察芽的大小就可以粗略估计哪个细胞处于某种生长发育阶段。当培养基中营养元素耗尽时，酵母细胞会停止生长而滞留在特定生长发育阶段，因此，可以通过观察显微镜下酵母细胞的出芽频率确定酵母的营养状态。

酵母单倍体和二倍体细胞在形态上有相似性，但也存在重要的差异。首先，二倍体细胞的直径大约是单倍体的1.3倍。其次，二倍体细胞呈长形或卵圆形而单倍体细胞通常接近圆形。第三，二倍体细胞和单倍体细胞的出芽方式不同。每个酵母细胞衰老前一般出芽20次，在母细胞表面以一定的方式连续出芽。单倍体细胞按照沿轴线的方向出芽，新芽与前一个芽紧密相连。二倍体细胞按极性方向出芽，新芽可以出现在长形细胞的任何一端。

酵母细胞有三种交配型MATa，MATα以及由这两种细胞相互交配形成的第三种交配型MATa/α。MATa/α不能与MATa和MATα中任何一种细胞交配。一般而言，MATa和MATα为单倍体，MATa/α为二倍体，但有例外。带有不同突变的单倍体细胞之间发生交配可以将不同的突变基因组合在同一个细胞中，为研究基因之间的相互关系提供了良好的实验材料。

野生型酵母属于原养型，只要培养基中有足够可利用的碳源和氮源，酵母细胞就能合成自身需要的各种营养物质。酵母首选碳源是葡萄糖，但也能利用其它很多种糖类。如果碳源适宜，酵母细胞首选通过酒精发酵产生能量。酵母细胞是条件性厌氧菌，在有氧和无氧状态下都能生存。

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二倍体酵母细胞在低氮、无发酵性碳源的条件下（营养缺乏，“饥饿”条件）能通过减数分裂形成单倍体孢子。此时，每个单倍体细胞在遗传背景上完全相同，从单个孢子来源的所有细胞都带有一套相同的染色体DNA。这些单倍体细胞中的某些重要基因发生突变后，因为不存在等位基因，很容易导致酵母细胞生长发育异常而发生表型变化。图6-38以酵母亮氨酸合成基因为例介绍了二倍体细胞通过减数分裂形成单倍体细胞的过程。

6. 5. 2 酵母基因转化与性状互补

利用Yip（整合型质粒）可以对酵母基因组中的任意基因进行精确的敲除（置换），并通过孢子繁殖中的四分体分析技术进行观测和研究。带有致死突变位点和可能的外源功能互补基因的酵母二倍体细胞在饥饿条件下形成四分体孢子，将这四个孢子用酵母四分体分离系统分开，如果所引入的外源基因具备互补突变位点的功能，含有突变基因的单倍体可以存活，否则就不能存活。图6-39中将多个棉花KCS基因（编码超长链脂肪酸合成酶）克隆到含有URA3筛选标记的表达质粒上，用带有URA3筛选标记的表达质粒替换带有TRP1筛选标记的质粒，实验发现，KCS12和KCS6基因都能完全互补野生型的表型，KCS13和KCS2虽然没有导致野生型的表型，但仍能使酵母细胞恢复生长，表明这些KCS基因都具备与elo2或elo3相似功能。

6. 5. 3 外源基因在酵母中的功能鉴定

将外源基因克隆于酵母表达载体上，转化野生型或突变酵母菌株，通过观察酵母的表型变化或分析细胞中化学成分的变化即可推测该基因的生物学功能。例如，在酵母细胞中表达外源基因与绿色荧光蛋白基因的融合蛋白后，可通过荧光显微镜观察荧光所在的亚细胞区域，从而了解该基因产物在细胞中的定位。野生型酵母细胞中18碳不饱和脂肪酸主要是C18:1，这些细胞不能产生含有两个或多个双键的不饱和脂肪酸，若将棉花中可能编码ω-6脂肪酸脱氢酶的基因转入野生型酵母细胞中，诱导该基因的表达，然后用气相色谱和质谱技术分析细胞的脂肪酸组成，在带有棉花基因的酵母细胞中可能出现C18：2不饱和脂肪酸，证明该基

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