达过程中可通过选择性剪切产生各种形式的mRNA。最新的研究表明，果蝇的Dscam基因最多可能够产生38，016种不同形式的剪切体（图6-5）。由于选择性剪切与细胞生理、发育调节以及肿瘤的发生、转移等有密切关系，阐明基因的选择性剪切机制是了解动植物个体发育和基因功能的重要环节。因此，发现新的可变剪切异构体，确定每个异构体的独特功能和生物学意义并阐明其调节机制，是功能基因组时代的一个重要特征。

6. 1. 3 原位杂交技术

原位杂交( In Situ Hybridization，ISH) 是用标记的核酸探针，经放射自显影或非放射检测体系，在组织、细胞、间期核及染色体上对核酸进行定位和相对定量研究的一种手段，通常分为RNA原位杂交和染色体原位杂交两大类。RNA原位杂交用放射性或非放射性（如地高辛、生物素等）标记的特异性探针与被固定的组织切片反应，若细胞中存在与探针互补的mRNA分子，两者杂交产生双链RNA，就可通过检测放射性标记或经酶促免疫显色，对该基因的表达产物在细胞水平上做出定性定量分析（图6-6）。

荧光原位杂交（fluorescence in situ hybridization，FISH）技术首先对寡核苷酸探针做特殊的修饰和标记，然后用原位杂交法与靶染色体或DNA上特定的序列结合，再通过与荧光素分子相耦联的单克隆抗体来确定该DNA序列在染色体上的位置（图6-7）。FISH技术不需要放射性同位素，实验周期短，检测灵敏度高，若用经过不同修饰的核苷酸分子标记不同的DNA探针，还可能在同一张切片上观察几种DNA探针的定位，得到相应位置和排列顺序的综合信息。

6. 1. 4 基因定点突变（site-directed mutagenesis）技术

定点突变是重组DNA进化的基础，该方法通过改变基因特定位点核苷酸序列来改变所编码的氨基酸序列，常用于研究某个（些）氨基酸残基对蛋白质的结构、催化活性以及结合配体能力的影响，也可用于改造DNA调控元件特征序列，修饰表达载体，引入新的酶切位点等。由于迄今尚未建立能精确预测特定氨基酸残基变化对整个蛋白结构及活性影响的模型，选择氨基酸突变的位点存在一定的盲目

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性。因为即使知道了该蛋白的三维结构，人们仍然无法了解某个氨基酸残基对其高级结构的影响。少数几个氨基酸残基的改变，有时根本不影响靶蛋白的功能，有时影响了靶蛋白的活性位点，有时还能从根本上改变整个蛋白的高级结构。所以，基因的定点突变是我们进一步了解蛋白质的结构与功能关系的重要手段。

最早在20世纪70年代初进行小噬菌体ΦX174单链基因组易突变位点图谱分析工作时认识到基因定点突变的可能性。在人工成功合成寡聚核苷酸、获得高品质DNA聚合酶和DNA连接酶的基础上，科学家建立了体外寡核苷酸介导的DNA突变技术（图6-8）。PCR技术的出现大大促进了定点突变技术的发展，简化了实验操作程序，提高了突变效率。科学家主要采用两种PCR方法，重叠延伸技术和大引物诱变法，在基因序列中进行定点突变。

图6-9阐述了重叠延伸介导的定点诱变机制。首先将模板DNA分别与引物对1（正向诱变引物FM和反向引物R2）和2（正向引物F2和反向诱变引物RM）退火，通过PCR1和2反应扩增出两种靶基因片段。FMR2和RMF2片段在重叠区发生退火，用DNA聚合酶补平缺口，形成全长双链DNA，进行PCR3扩增。最后，用引物F2和R2扩增出带有突变位点的全长DNA片段（PCR4）。

大引物诱变法首先用正向突变引物（M）和反向引物（R1），扩增模板DNA产生双链大引物（PCR1），与野生型DNA分子混合后退火并使之复性，第二轮PCR中加入正向引物（F2），与PCR1中产生的一条互补链配对，扩增产生带有突变的双链DNA（图6-10）。由于F2的退火温度显著高于第一轮PCR所使用的引物M和R1，因此，可以忽略引物M和R1在本轮反应中所造成的干扰。获得定点突变PCR产物以后，一般需进行DNA序列分析以验证突变位点。

与经典定点突变方法相比，PCR介导的定点突变方法具有明显的优势：1、突变体回收率高，以至于有时不需要进行突变体筛选；2、能用双链DNA作为模板，可以在任何位点引入突变；3、可在同一试管中完成所有反应；4、快速简便，无需在噬菌体M13载体上进行分子克隆。所以，PCR介导的定点突变方法已成为定点突变的主要技术。

6. 2 基因敲除技术

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6. 2. 1 基本原理

经典遗传学（Forward genetics）是从一个突变体的表型出发，研究其基因型，进而找出该基因的编码序列。在后基因组时代，大规模基因功能的研究正成为生命科学研究的热点，现代遗传学（Reverse genetics，反向遗传学）首先从基因序列出发，推测其表现型，进而推导出该基因的功能。基因敲除（gene knock-out）又称基因打靶，该技术通过外源DNA与染色体DNA之间的同源重组，进行精确的定点修饰和基因改造，具有专一性强、染色体DNA可与目的片段共同稳定遗传等特点。

1985年，科学家利用同源重组将一段外源质粒p△β117插入到人类染色体DNA β-珠蛋白位点，首次在哺乳动物细胞中进行基因打靶并获得成功。目前，在胚胎干细胞中进行同源重组已经成为遗传修饰基因组位点的常规技术。通过对这些基因敲除生物个体的表型分析，鉴定或推测该基因的生物学功能。

基因敲除分为完全基因敲除和条件型基因敲除（又称不完全基因敲除）两种。完全基因敲除是指通过同源重组法完全消除细胞或者动物个体中的靶基因活性，条件型基因敲除是指通过定位重组系统实现特定时间和空间的基因敲除。噬菌体的Cre/Loxp系统、Gin/Gix系统、酵母细胞的FLP/FRT系统和R/RS系统是现阶段常用的四种定位重组系统，尤以Cre/Loxp系统应用最为广泛。

1．完全基因敲除

实验中一般采用取代型或插入型载体（图6-11）在ES细胞中根据正-负双向选择（positive-negative selection, PNS）原理（图6-12）进行完全基因敲除实验。正向选择基因neo通常被插入载体靶DNA功能最关键的外显子中，或通过同源重组法置换靶基因的功能区。neo基因有双重作用，一方面形成靶位点的插入突变，同时可作为正向筛选标记。负向选择基因HSV-tk（human semian virus-thymidine kinase）则被置于目的片段外侧，含有该基因的重组细胞不能在选择培养基上生长。如果细胞中发生了随机重组，负向选择基因就可能被整合到基因组中，导致细胞死亡。由于基因转移的同源重组自然发生率极低，动物的重组概率约为10-2～10-5，植物的概率为10-4～10-5，即使采用双向选择法也很难保证一次就从众多细胞中筛选出真正发生了同源重组的胚胎干细胞，必须用PCR及

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Southern杂交等多种分子筛选技术验证确实获得了目的基因被敲除的细胞系。

2．条件型基因敲除

对于许多有重要生理功能的基因来说，完全基因敲除往往导致胚胎死亡，有关该基因功能的研究便无法开展。而条件型基因敲除，特别是应用Cre/LoxP和FLP/FRT系统所开展的组织特异性敲除，由于其可调节性而受到科学家的重视。构建条件型基因敲除打靶载体时，常将正向选择标记neor置于靶基因的内含子中，并在靶基因重要功能域两侧内含子中插入方向相同的LoxP位点（图6-13）。当实验中需要消除靶基因活性时，与带有Cre重组酶基因的ES细胞杂交，Cre重组酶就能把两个LoxP位点中间的DNA片段切除，导致靶基因失活。标记基因两侧也常常带有LoxP序列，因为许多时候即使标记基因位于内含子中也会阻断靶基因的转录。一旦出现这种情况，可以用Cre重组酶表达质粒转染中靶ES细胞，通过LoxP位点重组将neo抗性基因删除。

以Cre/loxp系统为基础，可以在动物的一定发育阶段和一定组织细胞中实现对特定基因进行遗传修饰。利用控制Cre表达的启动子活性或所表达的Cre酶活性具有可诱导性的特征，人们常常通过设定诱导时间的方法对动物基因突变的时空特异性进行人为控制，以避免出现死胎或动物出生后不久即死亡的现象。

6. 2. 2 高等动物基因敲除技术

胚胎干细胞（ES细胞）分离和体外培养的成功奠定了哺乳动物基因敲除的技术基础。真核生物基因敲除的技术路线主要包括构建重组基因载体，用电穿孔、显微注射等方法把重组DNA导入胚胎干细胞纯系中，使外源DNA与胚胎干细胞基因组中相应部分发生同源重组，将重组载体中的DNA序列整合到内源基因组中并得以表达，主要实验流程及筛选步骤如图6-14所示。

利用Neo基因替换目的基因外显子IV至外显子VI区段，得到肠碱性磷酸酶（Intestinal Alkaline Phosphatase，IAP）基因敲除的ES细胞，用显微注射或电穿孔法将IAP基因敲除的ES细胞注入早期胚胎的囊胚腔中，诱导胚胎分化，获得嵌合体胚胎后与野生型纯合体胚胎回交，获得由ES细胞分化产生的IAP基因

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