iTRAQ技术需注意的问题与答疑

1．Itraq的原理是什么？

Itraq的检测可以做这样的比喻，蛋白被打成肽段后，被平均的铺在了一个有384个孔的平板上，然后机器会从每个孔中选取浓度在前5名的蛋白进行鉴定和比对，所以，如果假设每个一个样本中有100个蛋白，他们的浓度均为1%，那么得到的结果就是蛋白的得分低，但是鉴定的蛋白数量会很多，可以达到90以上；如果一个样本中有100个蛋白，有3个蛋白的含量分别为30、20、10、其他的97钟蛋白为剩下的50%，那么这三种蛋白的得分高，但是鉴定出的蛋白数量会比较少，也许只有50或者60个。因为一些高丰度的蛋白会大量分部在上述的小孔中，抑制了其他蛋白的检出效果。

2．iTRAQ的主要优势是什么？

(1)高通量。一次性定性和定量该样本的总蛋白，不用像双向电泳（2DE）或DIGE要逐个斑点做鉴定；2DE可分离1500-2500个斑点(并且可能很多斑点对应同一种蛋白)，而iTRAQ一般可鉴定2000种以上蛋白，其中常规动物组织或细胞可鉴定到4000-7000种蛋白；

(2)结果直观、分析灵活——直接得到蛋白的定性和相对定量信息，可利用统计学方法快速筛选出各个组别的差异蛋白；能更好的结合基因组或转录组的数据，十分有利于后续研究。

(3)对样本类型无限制——任何类型的样本均可做，当然数据库越全、鉴定到的蛋白种类越多；对于罕见物种，可提供转录组数据来检索，更容易找到有意义的蛋白。

(4)一次上机的样本数高达8个，如果样本数多于8个，还可以在每次上机时设置内参，每个样本先跟内参比较，再相互比较（排除操作、环境和仪器误差），从而实现多组样本间的差异蛋白分析。

3．iTRAQ与其他蛋白质组学技术有何不同，我们该如何选择？

双向电泳是最早、最经典的蛋白质组技术，适用于大部分样本，只是对强酸或强碱性蛋白，以及分子量太大或太小的蛋白质分离效果不好；另外由于各个样本需要单独跑胶，很难避免操作误差对结果的影响，可能导致定量不准确；但是双向电泳的服务价格相对便宜，可以用于样本差异的初步筛选； DIGE在双向电泳基础上做了改进，引入了荧光标记物和内标，可以使定量更加准确；但该技术也是依据蛋白的等电点和分子量分离，因此对强酸或强碱性蛋白，以及分子量太大或太小的蛋白质分离效果也不好。

iTRAQ、TMT、label-free和SILAC都是利用液质联用技术来寻找差异蛋白。其中，iTRAQ和TMT的原理和检测方法基本一致，只是使用了不同的标记物；TMT有10种标记物，可对多达10种不同样

本进行分析，但是由于其标记物的质量数非常相近，因此必须使用超高分辨率的质谱（Thermo公司的QE质谱仪）才可以满足检测，这也必然会导致信号干扰更多，可能会影响定量的准确性；label-free是非标记的蛋白质组学技术，由于没有标记物，其定量需要依赖于操作和质谱仪的稳定性，该技术鉴定到的蛋白数目会少于iTRAQ技术，并且定量的准确性较差，优势是服务费用较低；SILAC是基于稳定同位素标记的细胞培养技术的蛋白质组学方法，利用不同的同位素培养基来培养不同组别的细胞，达到体内标记的目的，其定量准确性要比其他蛋白质组学技术更高；但是由于缺乏合适的同位素培养基，该方法基本只能用于可传代的哺乳动物细胞系。

从定量准确性、应用性等各方面综合考虑， iTRAQ技术已成为近年来利用最广泛的蛋白质组学技术。

4．iTRAQ实验对样本有何要求?

任何类型的样本都可以，如果是罕见物种，可以用近缘物种的数据库检索，也可提供转录组数据库来检索；一次上机，每组样本需要用200ug蛋白，但由于需要蛋白定量检测和预实验，因此每组样本所需的蛋白量大概在500ug左右；我公司负责蛋白质的提取，客户只需要提供足够的原始样本。

5．不同类型的样本做iTRAQ可否一次上机？

不能。如果样品来源于不同物种，检索时就无法选择数据库，也就无法分析数据；即使是同一物种的样本，它们的蛋白种类和丰度也可能有很大差别（比如植物的根和叶），将这些酶切肽段混合上机，其数据会相互干扰，导致蛋白定性和定量的不准确。

6．iTRAQ实验是否需要设置重复？

我们常说的重复包括生物学重复和技术重复，iTRAQ中常说到的还有上机重复；生物学重复即样本重复，采集来源于同一组别的不同样本（例如同样处理的不同植物、同一疾病的不同患者血清等），通常设置3个生物学重复，但临床样本一般要求生物学重复更多（如疾病组和健康组各十几例样本）；当生物学重复的样本很多时，可以将同组样本混合后再标记，便可以通过一次上机检测；技术重复，通常是同一个样本用不同标记物标记，这样可以排除因蛋白提取、酶解、标记等操作引入的误差；另外ITRAQ实验有时会设计上机重复，这其实也属于技术重复的范畴，即相同的样本上两次机，来排除操作误差和仪器误差。目前发SCI论文一般需要设置重复（无论何种重复），否则可能会被质疑数据的准确性；另外从数据质量上讲，重复能更有效的帮助我们排除不可信蛋白，无论是对WB验证还是后续研究，都是很有利的。

7．iTRAQ的重复性好不好？

我们通常所考虑的iTRAQ重复性指定量的重复性，即同样的样本在上机两次时得到的结果是否一致；iTRAQ实验重复性的好坏就决定了数据的准确性。一般来说，由于质谱选取肽段的随机性，可能导致检测到的肽段及其强度不同，在经过软件匹配分析后，得到的蛋白比值可能会不一样。一般得分和比值比较靠后的蛋白才会出现定量的严重偏差，而绝大部分蛋白的比值趋势是一致的。因此在分析时，我们会将鉴定到的蛋白先按FDR（错误发现率）或unused值进行筛选，选取置信度大于95%（unused＞1.3）或99%（unused＞2）的蛋白作为可信蛋白，再进行分析。

8．我们的仪器定性和定量的准确性如何？

辉骏生物使用的是Thermo Scientific Q Exactive Orbitrap LC-MS/MS System，该仪器将高性能四极杆的母离子选择性与高分辨的准确质量数（HR/AM）Orbitrap检测技术相结合，可显著提高样品的分析通量和数据质量：

①超高分辨率(高达140,000 FWHM)——区分分子量差异的能力强；

②质量精度优，使用全自动AGC和质量校准程序，在全扫描和全部离子碎裂(AIF)模式下质量精度优于1 ppm；

③扫描速度快，快速扫描频率达到12Hz，与UHPLC快速色谱技术联用时可确保精确质量分析；在任何扫描模式下，快速极性切换无需牺牲质量精度；在35,000分辨率下，一个正离子和一个负离子扫描的完整周期分析仅需1秒；

④质量范围广，扩展至50 - 6,000 m/z，可分析完整蛋白和单电荷离子；

全部离子碎裂(AIF)采用多重碎裂技术，离子源碰撞诱导解离(CID)和可选的高能量碰撞解离(HCD)，使得MS和MS/MS数据能够得到增强的结构信息；

⑤四极杆质量数过滤器：高级四极杆技术(AQT)提高母离子选择和传输能力，使复杂基质中低丰度分析物的定量更准确；

⑥多重检测能力提高单个周期的分析效率：精密的数据非依赖采集(DIA)和平行反应监测(PRM)用以实现更高置信度、更好重现性以及更高通量的定量分析结果；

⑦新的S型离子光学，使灵敏度提高3倍

⑧高效软件SIEVE 2.0可用于蛋白、肽段和代谢物的差异表达分析

9．按什么标准来选取差异蛋白？

差异蛋白的选取目前并没有统一标准，有多种选择方法，根据比值筛选，结合比值和标准差筛选，或根据T-Test筛选；我们目前一般根据比值进行选择，即差异倍数≤0.67和≥1.5，有时也会按照p≤0.05的标准过滤。

10．iTRAQ实验的数据采用不同数据库检索时，各组间的比值为何是不同的？

iTRAQ技术中不同标记物之间的比值与检索数据库、质谱电信号的噪音以及采集质谱时的随机性都有关。所以在使用不同数据库检索时，由于匹配肽段情况的不同，定量结果也有些许差异，但是总体变化趋势应是一致的。

11．检索时为什么同一个编号对应了很多蛋白质？

因为一个蛋白家族中常常含有多个同源性很高的蛋白质，这些蛋白质被酶切之后，很可能会产生很多相同的肽段，软件在进行定性分析时，就会将这些肽段均归于得分最高的那种蛋白质，其他同源蛋白不计分，并且这些同源蛋白都采用同一编号。

12．LC/MS中蛋白处理是定量还是定性？

这是属于定量，需在蛋白定量后，各取相同量（50-100ug）的蛋白（体积不大于25ul，少于25ul的用专用裂解液补至25ul）进行还原化和烷基化。

13．LC/MS对需要检测的蛋白有量的要求吗？

有的，要求蛋白量最低50ug，浓度最低要为5ug/uL，否则同位素无法标记。

14．数据分析中主要看哪些参数？

对于液质联用的数据分析，一般观察的参数为：Total Ion Score C.I. %（可信度）和Tag-80/Tag-0（两样本的比值）。

15．众多可信度数值中，主要选择哪些进行研究？

一般来说可信度在80%以上的均为可信程度非常高的。有些蛋白可信度在60%以上的也可以作为参考数据。

16．可信程度低于80%的数据有意义吗？

可信程度低于此值的，如果有感兴趣的蛋白可以通过ELISA、WB、Q-PCR、液态芯片等技术手段进一步验证，毕竟LC/MS是研究蛋白组学的方法之一，如全面研究还是要综合各种研究方法。

17．两样本的比值都代表什么？

两样本的比值如果在0.9-1.1之间的，可以认为两样本的含量是一样的，即比值为1：1；而小于0.9或大于1.1均可认为两样本之间的比值是有差异的。

18．质谱图中显示的是各种蛋白吗？

不是各种蛋白而是蛋白被打碎后的离子图谱，由于质谱法是电场和磁场将运动的离子（带电荷的原子、分子或分子碎片）按它们的质荷比分离后进行检测的方法。测出的是离子的准确质量，由此来确定离子的化合物组成。

19．目前开展该项业务的公司有很多，能否推荐下哪家公司做的比较好？

目前能开展itraq的公司挺多的，个人推荐广州辉骏生物做的相对还是不错的。现在据说服务质量挺好，周期大约1个月左右。

20．如果打算开展该项试验，需要提供什么样的样品形式？

最好是提供抽提好的蛋白，冻成干粉，然后用干冰快递过来。组织蛋白抽提不能用含二维电泳的变性剂来裂解蛋白。如果组织的话，存放到-80度冰箱中，然后用干冰快递过来，上海本地的，也可以将组织用冻存管装好，投入液氮中运过来即可。