专业： 生物信息

实验报告

姓名：

学号： 3140100477 日期： 2015.09.30

课程名称： 生物化学实验（甲） 指导老师： 毛旭明 成绩：__________________ 实验名称： 蔗糖酶的提取 实验类型： 提取、分离 同组学生姓名： 一、实验目的和要求（必填）

二、实验内容和原理（必填）

三、实验材料与试剂（必填） 四、实验器材与仪器（必填）

装订线五、操作方法和实验步骤（必填） 六、实验数据记录和处理 七、实验结果与分析（必填） 八、讨论、心得

一、实验目的和要求

学习掌握蔗糖酶的提取、分离纯化的基本原理和方法。

二、实验内容和原理

1、酵母细胞破碎

本实验采用研磨的方法。通过固体剪切法（研磨）将酵母细胞破碎，把蔗糖酶从酵母细胞中提取出来

2、蔗糖酶的初步分离纯化

蛋白酶常用的初步分离纯化方法有：盐析、选择性变性、有机溶剂沉淀等。

本实验采用选择性变性（加热）、有机溶剂（乙醇）沉淀等方法对蔗糖酶进行初步的提纯。 由于酶蛋白在分离纯化过程中易变性失活，为了能获得尽可能高的产率和纯度，在提纯操作中要始终保持酶的活性，如在低温下操作等，这样才能收到较好地分离提纯效果。

三、实验材料与试剂 1、实验材料

市售干酵母粉 10g/组(3～4人） 2、实验试剂 ⑴ 石英砂，

⑵ 95% 乙醇(-20℃），

⑶ 20mmol/L Tris-HCl pH7.3 缓冲液。

四、实验器材与仪器

1、电子天平（称量样品）； 2、研砵（每组一套）；

3、50ml高速离心管（4支/组、4孔50ml离心管架一个/组）； 4、托盘天平（离心管平衡用）； 5、高速冷冻离心机； 6、恒温水浴箱（50℃）； 7、制冰机；

8、1.5ml离心管（留样品Ⅰ、Ⅱ用）及离心管架 ； 9、7ml离心管（留样品Ⅲ用）及离心管架 ； 10、－20℃冰箱。

五、操作方法和实验步骤 分组操作：每组3～4人。 1、酵母细胞破碎

称取市售干酵母粉10g，约3-5 g石英砂放入研钵中直接干燥充分研磨至尽可能成细粉末状（约15分钟），量取总体积30-40 ml的20mmol/L Tris-HCl pH7.3 缓冲液，分2次加在研砵内研磨10分钟，使呈糊状液体；将糊状液体转移到2支50ml离心管中，两支离心管平衡后，4℃、12000r/min离心15分钟，收集上清液并量出体积V1（样品I）,另留1ml上清液（样品I ）放置－20℃冰箱保存，用于蔗糖酶蛋白含量测定、蔗糖酶活力测定和SDS-PAGE分析。 2、热处理：

将上一步抽提液（样品I），迅速放入50℃恒温水浴中，保温30分钟，并用玻璃棒温和搅拌抽提液，保温后迅速用冰浴冷却5分钟，转移至两支50ml离心管中，平衡后， 4℃，15000r/min离心15分钟，收集上清液并量出上清液体积V2（样品Ⅱ），另留1ml上清液（样品Ⅱ）放置－20℃冰箱保存，用于蔗糖酶蛋白含量测定、测定蔗糖酶活力和SDS-PAGE分析。

3、有机溶剂（乙醇）沉淀：

将热处理后的上清液逐滴加入相同体积的－20℃的95%乙醇，冰浴中温和搅动混匀，至少放置20分钟，然后转移至两支50ml离心管中，两支离心管平衡后，4℃，12000r/min离心10分钟，弃去上清液，沉淀放置－20℃冰箱保存，以备用于下周实验——离子交换柱层析分离纯化蔗糖酶。

六、实验数据记录和处理 数据记录： 酵母粉M1=10.00g； 石英砂M2=3.00g； 第一次上清液V1=24.5ml； 第二次上清液V2=21.4ml；

七、实验结果与分析

1、第一次离心后离心管中试剂分为三层：最上方为白色的脂溶性物质；中间为清液，略呈黄色；最下

层为沉淀。此次用滴管取出上清液保留。

2、50℃水浴使热不稳定的蛋白变性，而蔗糖酶不变性，所以第二次离心后仍保留上清液。 3、实验过程中试剂可能会由于发酵产生气泡，低温冷却是为了防止发酵。

4、第二次离心后得到的上清液，加入乙醇后产生沉淀，蔗糖酶由于耐乙醇而在沉淀中，且乙醇浓度适中，蔗糖酶未变性。

八、讨论、心得

心得：

1、研磨的时候要彻底，最好由男生轮流来；

2、细胞破碎的各种方法中，固体剪切法（研磨法）简单易行，而且干磨法比湿磨法所得到的蔗糖酶产率更高，故选用干磨法；

3、本实验在对蔗糖酶进行初步纯化时的两次蛋白质沉淀的原理是不一样的，第一次是蛋白质在高温条件下变性失活，第二次是在有机溶剂中沉淀，蛋白质保持原有构型和活性。因为蔗糖酶比较耐高温，可以在50摄氏度时保持活性，因此蔗糖酶在纯化过程中不会有太大的损失。但是在离心等过程中，为了尽可能地保持蔗糖酶的活性，还是要在低温中进行。

4、在进行离心操作前，要先对两支离心管进行平衡（要盖上离心管的盖子，因为不同的盖子的质量也是不一样的），避免离心过程中产生较大噪音甚至损坏离心机。

思考题：

本实验在从干酵母中提取和分离纯化蔗糖酶的过程中具体运用了哪些方法？你认为还有哪些方法可以运用？说说你的设想。

用研磨的方法提取，用选择性变性和有机溶剂沉淀方法分离纯化；

还可以用纤维素酶和果胶酶破坏酵母的细胞壁来获得细胞之中的蔗糖酶，可以用盐析的方法分离纯化，蛋白质在不同盐浓度的溶液中溶解度不同。