第十二章造血干细胞及免疫细

胞的生成

2015年7月6日7时55分第一节造血干细胞的特性和分化

一、造血干细胞的起源和表面标记?造血干细胞的起源：（哺乳动物）最早卵黄囊→胎肝→（胚胎发育中期及出生后）→骨髓早期的造血干细胞：多能造血干细胞（具自我更新和分化两种潜能）→（最初分化为）共同淋巴样祖细胞和共同髓样祖细胞等。2015年7月6日7时55分2015年7月6日7时55分ES及其分化造血干细胞的分化途径红母细胞髓红系干细胞红细胞血小板造血干细胞的分化途径Differentiation of hematopoietic stem cells再生巨核细胞嗜碱性粒细胞肥大细胞髓系干细胞造血干细胞？嗜酸性粒细胞树突状细胞嗜中性粒细胞粒-单核系干细胞单核细胞B 淋巴细胞NK细胞淋巴系干细胞？2015年7月6日7时55分T 淋巴细胞树突状细胞外周血中各种白细胞的比例免疫细胞占白细胞总数百分比（%）中性粒嗜碱性粒细胞嗜酸性粒细胞单核细胞淋巴细胞树突细胞40-750.1-11-72-1120-350.1-12015年7月6日7时55分BLOOD ELEMENTSLEUKOCYTES WBCsLymphocytesErythrocytesRBCsGranulocytes{Neutrophil PMNEosinophilBasophilPlateletsMonocytes2015年7月6日7时55分造血干细胞的表面标记

人造血干细胞的主要表面标记为CD34和c-kit(CD117)，无谱系特异性标记（Lin-）：1.CD34是造血干细胞的一种重要标记分子，为高度糖基化跨膜蛋白，包括造血干细胞，有1%~4%骨髓细胞表达CD34。应用CD34可从造血组织中分离造血干细胞，成熟血细胞不表达此分子。2015年7月6日7时55分2.CD117即c-kit是干细胞因子（stem cell factor）的受体，为原癌基因c-kit的产物kit，属于含有酪氨酸结构的生长因子受体。CD117+约占骨髓细胞的1%~4%，50%~70í117表达CD34，故CD117也是多能造血干细胞的重要标记。2015年7月6日7时55分-3.Lin细胞

应用针对T细胞、B细胞、NK细胞、单核细胞、巨噬细胞、巨核细胞、髓系、红系等多种谱系相应单克隆抗体的混合抗体（CD2、CD3、CD14、CD16、CD19、CD24、CD56、CD66b、血型糖蛋白质A等抗体）结合免疫磁珠分离法，除去造血组织-中各谱系细胞，所留下即为Lin细胞（早期造血干细胞）。2015年7月6日7时55分二、造血干细胞的分化

?多能造血干细胞的分化:骨髓、胸腺造血微环境提供造血干细胞发育分化的必要条件。通过动物体内或人工体外半固体微环境条件模拟，可进行造血干细胞分化的研究。2015年7月6日7时55分干细胞分化2015年7月6日7时55分干细胞体外分化2015年7月6日7时55分?多能造血干细胞的分化:骨髓、胸腺维持造血干细胞自我更新和分化的机制：I 分泌细胞因子或其他介质，促进不同谱系不同发育阶段细胞生长分化。如胸腺基质细胞分泌的细胞因子IL-7及肽类分子胸腺激素、胸腺素、促胸腺生成素是胸腺中T细胞成熟的重要条件。II 造血微环境基质细胞通过粘附分子及分泌的细胞外基质与干细胞及其分化的血细胞相互作用，提供必要刺激信号。2015年7月6日7时55分?定向干细胞及其分化:1.髓样干细胞及其分化：I 红系：红细胞生成素EPO是最重要的生长因子。髓样干细胞→（EPO、SCF存在下）→红细胞集落形成单位（CFU-E）。II巨核系：血小板生成素TPO是巨核细胞/血小板谱系分化中关键因子。髓样干细胞→（TPO、IL-6、IL-11）→巨核细胞集落形成单位（）2015年7月6CFU-MeG日7时55分?定向干细胞及其分化:1.髓样干细胞及其分化：Ⅲ粒单系：GM-CSF、SCF、IL-3起作用。髓样干细胞→具有产生粒细胞系、红细胞系、巨核细胞系和单核-巨噬细胞系潜能的集落形成单位（CFU-GEMM）→（在G-CSF/M-CSF/GM-CSF、SCF、IL-3存在下）→中性粒细胞或单核/巨噬细胞。2015年7月6日7时55分?定向干细胞及其分化:1.髓样干细胞及其分化：Ⅳ嗜酸性粒细胞：GM-CSF、IL-5、IL-3起作用。髓样干细胞→CFU-GEMM（在GM-CSF、IL-5、IL-3存在下）→嗜酸粒细胞集落形成单位（CFU-Eos）→嗜酸性粒细胞2015年7月6日7时55分?定向干细胞及其分化:1.髓样干细胞及其分化：Ⅴ嗜碱性粒细胞：IL-5、TGF-β起作用。髓样干细胞→CFU-GEMM（在IL-5、TGF-β存在下）→嗜碱性粒细胞集落形成单位（CFU-Baso）IL-3、IL-4→嗜碱性粒细胞2015年7月6日7时55分?定向干细胞及其分化:2.淋巴样干细胞及其分化：I T细胞谱系：在胸腺中发育获得功能TCR表达、自身MHC限制、自身耐受T 细胞发育双阴细胞CD4-8-/gdTCRCD3gdTCR进入外周双阴细胞CD4-8-双阳细胞CD4+8+双阳细胞CD4+8+abTCRCD4+单阳细胞进入外周Pro-TPro-TaPre-TCR信号通道Pre-TCRThy-1TCR b 链基因重排不发生b 链基因重排的细胞凋亡TCR a 链基因重排阳性和阴性选择失败的细胞凋亡CD8+单阳细胞进入外周2015年7月6日7时55分骨髓胸腺小叶CD3￣CD4￣/LOW CD8￣TCR￣被膜CD3￣CD4￣/LOW CD8￣TCR￣被膜下区CD3+ CD4+ CD8+TCRgd+CD3￣CD4+ CD8￣TCR￣CD3￣CD4￣CD8+TCR￣CD3+ CD4+ CD8￣TCRgd+CD3LOWCD4￣CD8+TCRabLOW皮质CD3+ CD4￣CD8+TCRgd+CD3+ CD4+ CD8+TCRab+CD3+ CD4￣CD8￣TCRgd+CD3+ CD4￣CD8￣TCRgd+CD3+ CD4+ CD8￣TCRab+CD3+ CD4￣CD8+TCRab+髓质CD3+ TCRgd+CD3+ CD4+TCRab+CD3+CD8+TCRab+2015年7月6日7时55分（1）T细胞受体基因重排（a）TCRα和β链基因重排：αβT细胞约占T细胞95％～99%，γδT细胞约占1％～5%。胸腺细胞在双阴性（DN）阶段的一个时期，即CD44low CD25+阶段，β链基因开始重排，表达β链蛋白，并与前T细胞替代α链PTα（Pre T Cel1α）组装成PTα：β二肽链，表达于CD44-CD25-阶段的细胞表面，此时细胞增殖活跃，IL-7R的表达对这个时期的分化发育至关重要；分化至CD4+CD8+PTα:βCD3low的双阳性（DP）阶段，细胞停止增殖，α链基因开始重排，并表达有功能性的TCRαβ。2015年7月6日7时55分（2）CD3及CD4/CD8的表达：阳性与阴性选择?阳性选择在胸腺皮质中，同胸腺上皮细胞表达的自身肽：MHCⅠ类或Ⅱ类分子复合物以适当亲和力进行特异结合的DP细胞，可继续分化为单阳性（SP）细胞，其中与Ⅰ类分子结合的DP细胞CD8表达水平升高，CD4表达水平下降直至丢失; 而与Ⅱ类分子结合的DP细胞，CD4表达水平升高，CD8表达水平下降最后丢失；不能与自身肽：MHC分子复合物发生有效结合或发生亲和力过高结合的DP细胞，在胸腺皮质中发生凋亡，占DP细胞的95%以上。约5％的DP细胞经选择而存活，此过程称为胸腺的阳性选择（postive selection）。2015年7月6日7时55分经阳性选择的DP细胞存活，并分化为SP细胞，使T细胞获得了在识别过程中自身MHC限制能力。识别MHCI类分子的胸腺细胞发育为CD8+细胞，而识别MHCⅡ类分子的胸腺细胞发育为CD4+细胞。2015年7月6日7时55分?

阴性选择（negative se1ection），系DP及SP

细胞在皮质区、皮髓质交界处及髓质区，与胸腺DC、巨噬细胞表达的自身肽：MHC I类或Ⅱ类分子发生高亲和力结合的而被消除，或成为无能状态，以保证入外周淋巴器官的T细胞库中不含有针对自身成分的T细胞，也是T细胞自身免疫耐受的主要机制。

2015年7月6日7时55分T细胞在胸腺内的阳性和阴性选择胸腺淋巴干细胞(DN)CD4+ 与MHC 适当TCR重排CD8+ 结合的T细胞不与MHC-自身肽结合的T细胞CD4+ Th细胞TT 阳性选择阴性选择T双阳性T细胞（DP）(DP)（SP）CD8+Tc细胞T细胞不与T细胞与MHC和自身单阳性MHC 结合抗原肽高亲和力结合T细胞(SP)凋亡外周2015年7月6日7时55分?定向干细胞及其分化:2.淋巴样干细胞及其分化：ⅡB细胞谱系：抗原非依赖阶段：在胚肝或骨髓成熟B细胞未成熟细胞前B细胞原B细胞淋巴干细胞sIgM+sIgD+sIgM+Ig 基因重排胞浆μ+抗原依赖阶段：外周淋巴器官抗原成熟B细胞活化B细胞记忆B细胞sIgM+sIgD+2015年7月6日7时55分sIgM+sIgD+sIgG+sIgA+浆细胞胞浆Ig 2015年7月6日7时55分（1）B细胞分化成熟过程

抗原非依赖期(骨髓内分化)①．祖B细胞(pro B cell)阶段②．前B细胞(pre B cell)阶段③．未成熟B细胞(immature B cell)④．成熟B细胞(mature B cell) 抗原依赖期(骨髓外分化)2015年7月6日7时55分（2）、B细胞在骨髓内的分化

B细胞来源于骨髓淋巴干细胞。早期B细胞的增殖分化与骨髓造血微环境(hemopoietic inductive microenviroment，HIM)密切相关。骨髓基质中的细胞因子和黏附分子是B细胞发育的必要条件。2015年7月6日7时55分①Ig基因重排

?Ig重链、轻链基因重排?原B细胞中首先开始Ig重链基因重排，并表达Igα/Igβ，如果重排有效，则产生μ链，因此时轻链尚未重排，μ链则与一条替代轻链（Vpre-B/λ5）结合，形成膜表面受体（前B细胞受体）。?前B细胞向细胞内发出信号，使B细胞进一步分化。如果轻链重排有效，则轻链与μ链结合，形成IgM表达在细胞表面。?膜表面IgM是不成熟B细胞的标志。2015年7月6日7时55分②阴性选择

?在骨髓中B细胞发育成熟过程中，V（D）、J基因重排是随机发生的，故有可能产生与自身抗原应答的B细胞克隆，或产生具有不合适抗原受体的B细胞克隆。但在周围淋巴器官中Ig基因可发生二次重排，二次重排会修正能与自身抗原应答的基因，以消除自身应答性B细胞（B细胞阴性选择）。藉Ig基因二次重排，对B细胞的抗原受体作修正时称为抗原受体编辑。?通过阴性选择后的不成熟B细胞，膜上表达Ig D，变成成熟B细胞离开骨髓进入外周淋巴组织，在脾脏中继续经历阴性选择。2015年7月6日7时55分骨髓内B细胞的阴性选择骨髓不与自身抗原高亲和力结合的B细胞淋巴干细胞BCR重排B阴性选择与自身抗原高亲和力结合的B细胞B外周凋亡2015年7月6日7时55分?定向干细胞及其分化:2.淋巴样干细胞及其分化：ⅢNk细胞：第九章第三节已涉及（略）。2015年7月6日7时55分第二节淋巴细胞抗原识别受体的编码基因及多样性产生

2015年7月6日7时55分一、BCR与TCR基因结构及其重排（一）胚系基因结构?V区基因和C区基因κ和λ轻链含有V、J、C三种片段，重链家族由V、D、J和C四种不同的基因片段所组成。V/D/JC2015年7月6日7时55分一、BCR与TCR基因结构及其重排（一）胚系基因结构?胚系基因的结构BCR或Ig的两条轻链(λ、κ)和一条重链分别由不同的多基因家族(multigene families)编码，人λ轻链基因位于第22号染色体，κ链位于第2号，重链(H)位于第4号。VHDH JH Cμ编码完整μ/δ链VLJH Cμ编码完整轻链sIgM/sIgD2015年7月6日7时55分一、BCR与TCR基因结构及其重排

（二）淋巴细胞发育过程中抗原受体的重排在B细胞发育分化过程中，Ig可变区将发生顺序性重排。首先是重链V区重排，然后是轻链V区重排。只有经过重排的B细胞才成为成熟型B细胞，即免疫潜能B细胞(immunocompetent B)。每个成熟的B细胞只含有一种功能性VH和VL(λ或κ)，其细胞膜表面表达膜结合型Ig，并只能与一种抗原表位相互作用。2015年7月6日7时55分（1）重组活化基因1/2（recombination activation gene 1 and 2, RAG1/2）L V1 V2 V3 V4 V5 Vn J1 J2 J3 J4 J5 J6C区RAG1/2L V1 V2J4 J5 J6RAG1/2C区连接酶L V1 V2J4 J5 J62015年7月6日7时55分（2）B、末端脱氧核苷酸转移酶（terminal deoxynucleotidyl transferase,TdT）TdTDt/A/C/GTPDt/A/C/GTP随机核苷酸加减AGCTAGCTAG连接酶AGCTAGCTAG2015年7月6日7时55分（3）Oct-2及NF-κB等调控序列启动子VH DH JH内含子增强子C区Oct-2（在B细胞特异表达）NF-κB参与轻链的转录2015年7月6日7时55分（4）类别转换2015年7月6日7时55分2015年7月6日7时55分IL-4诱导Ig重链基因重排的类型转换机制第一次重组重排切除的环状产物中包括Cμ，使Cμ转换为Cγ、（IgG1）2015年7月6日7时55分第二次重组，切除Cγ，使Cγ转换为Cε（Ig3E）二、抗原识别受体多样性产生的机制

?组合造成的多样性?连接造成的多样性CDR3区位于V、J和V、D、J片段连接处，两片段之间的连接可以丢失或加入数个核苷酸，从而显著增加了CDR3的多样性，增加了抗原识别受体多样性的数目?体细胞高频突变造成的多样性2015年7月6日7时55分多样性机制重链κ估计片段数目轻链λ种系中基因片段VDJ300~100013430004203可能组合数目V—J和V—D—J组合连接多样性连接的灵活度300×13×4＝1.6×104十300×4＝1.2×103十2×3＝6十P区核苷酸加入N区核苷酸加入体细胞突变轻、重链组合十十十十一十＞1.6×104×(＞1.2×103十＞6)＝＞＞1．9×l07十一十人Ig可变区片段的估计数目为：100个VH、30个DH和6个功能性JH，100个Vκ、5个Jκ，100个Vλ，6个Jλ。因此，人抗体多样性的数目与小鼠相似。(十)：表示与抗体多样性有关，但数目不详；(一)与抗体多样性无关2015年7月6日7时55分小鼠种系Ig基因的结构2015年7月6日7时55分重链基因重排及RNA加工2015年7月6日7时55分2015年7月6日7时55分图2-3 κ轻链基因重排及RNA加工缺失对接时P-核苷酸及N-核苷酸的加入

2015年7月6日7时55分2015年7月6日7时55分