长江大学生科院生物技术系 《发酵工程》讲义
第一章 绪论
教学目的：了解发酵工程的意义及组成，我国发酵工程的发展现状； 掌握微生物发酵的纯培养技术和深层培养技术的相关内容及发酵工程发展历史上的五个转折点；掌握发酵工程的产业化及其发展前景。
教学重点、难点：微生物发酵的纯培养技术和深层培养技术；发酵工程的产业化及其发展前景。
1.1 发酵工程的意义及组成
传统生物技术：抗生素、生物制药、氨基酸、核苷酸、有机酸、饲料添加剂、微生态制剂、生物农药、生物肥料等。
现代生物技术：基因工程菌发酵，基因工程药物、疫苗及抗体生产。 发酵工业范围：了解
发酵工程与现代生物技术的关系
发酵工程是生物技术的重要组成部分，是生物技术产业化的重要环节。它是应用微生物学等相关的自然科学以及工程学原理，利用微生物等生物细胞进行酶促转化，将原料转化成产品或提供社会性服务的一门科学。 由于它以培养微生物为主，故又称为微生物工程。 发酵工程的组成：从广义上讲，由三部分组成，上游工程、发酵工程、下游工程 上游工程：- genetics, cell ?（遗传学、细胞学）
- inoculum development（菌种培养）
-media formulation（载体表达） -sterilization（灭菌技术）
- inoculation（接种技术）
下游工程：- product extraction, purification & assay（产品分离、纯化及检验）
- waste treatment（废物处理） - by product recovery（产物回收）
发酵的定义：
1.传统发酵
发酵（fermentation）最初是来自于拉丁语“发泡”（ferver）这个词，是指酵母作用于果汁或发芽的谷物时产生二氧化碳的现象。
2.生化和生理学意义的发酵 指微生物在无氧条件下，分解各种有机物质产生能量的一种方式，如葡萄糖在无氧条件下被微生物利用产生酒精并放出CO2。
3.工业上的发酵
泛指利用生物细胞制造某些产品或净化环境的过程。 发酵过程的组成部分：
典型的发酵过程可划分成六个基本组成部分： （1）繁殖种子和发酵生产所用的培养基组份设定； （2）培养基、发酵罐及其附属设备的灭菌；
（3）培养出有活性、适量的纯种，接种入生产容器中；
（4）微生物在最适合于产物生长的条件下，在发酵罐中生长； （5）产物分离和精制；
（6）过程中排出的废弃物的处理。
1.2 发酵工程的发展历史
发酵现象→酿造食品工业→非食品工业→青霉素发酵→抗生素工业→氨基酸,核酸发酵（代谢控制发酵）→基因工程菌发酵→动物细胞大规模培养→植物细胞大规模培养→藻类细胞大规模培养→转基因动物
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（1）传统的微生物发酵技术——天然发酵 （2）第一代微生物技术—纯培养技术的建立
1675年荷兰Anthony Leeuwenhoek(列文虎克1632~1723)用自制的显微镜，观察到了微生物，包括细菌和酵母。
1857年法国的Louis Pasteur(巴斯德1822~1895)第一次证明酒精发酵是由活酵母引起的，各种不同的发酵产物是由不同的微生物产生的。被誉为微生物学的鼻祖，发酵学之父。
1897年德国Eduard Buchner(毕希纳1860~1917)将酵母细胞磨碎，得到的酵母汁加糖（蔗糖）能产生二氧化碳和酒精，从而阐明了微生物发酵的化学反应本质——酶催化。
1905年德国Rober Koch(柯赫1843~1910) 首先发明了固体培养基，得到了细菌纯培养物，建立了微生物纯培养技术，为发酵工程的建立起了关键作用。
纯培养技术的建立，开创了人为控制发酵过程的时期。这一时期的产品有：酵母、酒精、丁醇、有机酸、酶制剂等，主要是一些厌氧发酵和表面固体发酵产生的初级代谢产物。 （3）第二代微生物发酵技术—深层培养技术
1941年美国和英国合作对青霉素进行生产研究
表面培养：1升扁瓶或锥形瓶，内装200mL麦麸培养基。 ─── 40u/ml 1943年深层培养：5m3 ─── 200u/ml 当今：100m3─200m3 ─── 5-7万u/ml
青霉素发酵能成功的原因，主要是解决了两大技术问题： 通气搅拌解决了液体深层培养时的供氧问题。
抗杂菌污染的纯种培养技术：无菌空气、培养基灭菌、无污染接种、大型发酵罐的密封与抗污染设计制造。 ●随后链霉素、氯霉素、金霉素、土霉素、四环素等抗生素相继问世，形成了抗生素工业。伴随其兴起诞生的大型发酵罐，为发酵工程的发展提供了关键设备。
●20世纪50年代，日本人最早引进“代谢控制发酵技术”用于氨基酸发酵，氨基酸发酵工业得到快速发展； ●20世纪60年代，出现了石油发酵，如以石油为原料生产饲料酵母、柠檬酸、水杨酸等。
（4）第三代微生物发酵技术——微生物工程
● 1973年美国Boyer和Cohen首先在实验室实现了基因转移，为基因工程开启了通向现实的大门，此后很快在全世界各国的研究人员不但构建高产量的基因工程菌，还使微生物产生出它们本身不能产生的外源蛋白质，而且很快形成了基因工程产品，如胰岛素、生长激素、细胞因子、疫苗、单克隆抗体等。
值得一提的是，1973年人类通过基因工程手段构建了第一个“工程菌”，用它生产出了人生长激素释放抑制因子。
发酵工程发展的转折点：
第一个转折点：食品工业 →非食品工业 第二个转折点：青霉素发酵 → 抗生素工业 第三个转折点：代谢控制发酵 第四个转折点：发酵原料的改变 第五个转折点：基因工程引入发酵
1.3 我国发酵工程产业化现状及前景
1、发酵工程产业化的重要环节
发酵工程产业化就是将有关应用微生物的科学研究成果转化为发酵产品，并投向市场的过程。 三个环节：投产试验、规模化生产和市场营销。
2、我国发酵工程的发展现状
我国发酵工程经过长期发展已有一定基础，并一直持续快速发展。目前其产品涉及医药、保健、农药、食品、饲料、有机酸等方面。
中国的酿酒业，距今已有数千年的历史渊源。
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白酒：是我国特有的、具有悠久历史的传统酒种。
黄酒：是我国最古老的酒种，据史料记载已有6000年左右了。
葡萄酒：1892年华侨张弼士在烟台建立酿酒公司，这是我国第一个新型的葡萄酒酿造厂。目前我国葡萄酒工厂已有近八十家。2003年葡萄酒年产量约34万吨。
啤酒：1900年我国最早的啤酒厂于哈尔滨建成。2001年产量达到2200万吨左右。步入新世纪后，形成了青啤、燕京、华润“三强”鼎立。
在医药方面，抗生素得到迅猛发展，1998年抗生素产量达到33486 t，其中青霉素的产量居世界首位。其他生化药物中，初步形成产业化规模的有干扰素、白细胞介素、乙型肝炎疫苗等。
在农药方面，生物农药品种达85种，主要有苏云金芽孢杆菌（Bt）、井冈霉素、赤霉素等。其中井冈霉素的产量居世界首位。
在食品与饲料方面，作为三大发酵制品的味精、柠檬酸、酶制剂的产量也有很大增加，如味精产量22.3万吨（1990年）增加到71.3万吨（2001年），其生产和消费居世界第一；还有柠檬素的生产和出口也居世界第一。 在保健品方面，中国已能生产多种氨基酸、核酸、维生素等。 但是，也存在诸多问题。
中国发酵水平与国际先进水平的差距： ① 多数工厂规模小、效益低； ② 生产技术水平比较低； ③ 产品品种单一，结构不合理； ④ 应用的深度和广度不够；
⑤ 技术装备和检测手段落后，自动化水平低； ⑥ 综合利用和环境治理差。
3、发酵工程的发展前景
①基因工程的发展为发酵工程带来新的活力。
②新型发酵设备的研制为发酵工程提供先进工具。
③大型化、连续化、自动化控制技术的应用为发酵工程的发展拓展了新空间。 ④生态型发酵工业的兴起开拓了发酵的新领域。 ⑤再生资源的利用给人们带来了希望。
1.4 本课程的教学目的和内容
1、本课程的教学目的 2、教学内容
第一章 绪论 (4学时)
第二章 菌种的来源 (4学时)
第三章 发酵培养基 (4学时)
第四章 发酵工业的无菌技术 (4学时) 第五章 种子的扩大培养 (4学时)
第六章 抗生素发酵生产工艺(2学时)
第七章 啤酒发酵生产工艺(4学时) 第八章 氨基酸发酵生产工艺(2学时) 第九章 发酵过程控制 (12学时)
第二章 菌种的来源
教学目的：了解工业化菌种的要求以及一些工业化生产菌介绍；了解菌种分离的一般过程；掌握土样采集应注意的问题，菌种的分离方法；掌握优良菌种应具备的基本特性和菌种的选育。
教学重点、难点：土样采集应注意不同的土壤特点、地理和气候条件，土样的采集方法； 生化反应分离法；
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诱变育种。
第一节 工业化菌种的要求及已工业化产品生产菌介绍
一、工业化菌种的要求
? ? ? ?
能在廉价原料制成的培养基上生长，且大量高效地合成产物； 遗传性能要相对稳定；
菌种改造的可操作性要强； 抗噬菌体及杂菌污染能力强；
? 产生菌及其产物的毒性必须考虑（在分类学上最好与致病菌无关）； ● 发酵条件如温度、pH、溶解氧等易控制。
二、已工业化产品生产菌介绍
1、抗生素生产有关的微生物 2、氨基酸生产有关的微生物
50, 60年代以氨基酸发酵为代表的代谢控制发酵，是发酵工业发展历史上的一个转折点。
代谢控制发酵：用人工诱变的方法，有意识地改变微生物的代谢途径，最大限度地积累产物，这种发酵形象地称为代谢控制发酵，最早在氨基酸发酵中得到成功应用。 3、食品酶制剂生产有关的微生物
利用微生物来进行酶制剂生产是19世纪日本人用曲霉通过固体培养生产他卡淀粉酶，而大规模工业化生产则始于20世纪40年代末日本用深层发酵法生产α—淀粉酶。
第二节 自然界中目的微
生物的分离
一、菌种分离的一般过程
标本采集 → 预处理 → 富集培养 → 菌种分离（初筛、复筛）→ 性能鉴定 → 菌种保藏
二、微生物材料的标本采集
一般通过以下途径获得菌种： ①向菌种保藏机构索取有关菌株；
②由自然界采集样品，如土壤、水、动植物体等；
③从一些发酵制品中分离目的菌株，如从酱油中分离蛋白酶产生菌，从酒醪中分离淀粉酶或糖化酶产生菌。
自然界中微生物极其丰富，土壤是微生物最集中的地方，所以土壤样品往往是采集的首选目标。 土样采集应注意以下问题：
A、不同的土壤特点
因土壤组成、有机物浓度、pH等条件的不同，微生物的种群分布会非常不同。如菜园和农田常以细菌和放线菌较多（偏碱）；果园树根土壤中酵母菌含量较高（偏酸）；动植物残骸及腐殖土中霉菌较多；根瘤菌多在豆科植物根系土壤中分离；分解石油的微生物常在油田和石油炼油厂附近的土层中分布最多。 B、地理和气候条件
南方和北方，一年四季。许多工业微生物菌种，如抗生素产生菌，尤其是霉菌、酵母菌，大多从南方。秋季采土样最为理想。
采土样的方法：南方，用取样铲，将表层5cm（阳光直射，蒸发量大水分少，而且受紫外线照射）左右的浮土除去，取5～25cm处的土样10～25g，装入事先准备好的塑料袋内扎好。北方土壤干燥，可在10～30cm处取样。给塑料袋编号并记录地点、土壤质地、植被名称、时间及其他环境条件。一般样品取回后应马上分离，以免微生物死亡。
C、微生物的生理特性
Ｄ、极端环境条件下采样分离
极端微生物的采集。
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三、标本的预处理
提高菌种分离的效率。表2-2（P31）
四、目的微生物富集的一些基本方法
? 富集的目的：让目的微生物在种群中占优势，使筛选变得可能。
富集培养是在目的微生物含量较少时，根据微生物的生理特点，设计一种选择性培养基或创造有利生长条件，使目的微生物数量增加，由原来自然条件下的劣势种变成人工环境下的优势种，以利于分离得到所需要的菌株。
? 富集的基本方法： 1、控制营养；（如以唯一碳源或氮源作底物） 2、控制培养条件，如pH、温度、通气量等； 3、抑制不需要的种类
五、菌种分离
1、常规分离法：划线法、稀释法和涂布法
2、生化反应分离法：透明圈法、变色圈法、抑菌圈法、生长圈法
透明圈法：在平板培养基中加入溶解性较差的底物，使培养基混浊，这样能分解该底物的微生物便会在菌落周围产生透明圈。
圈的大小可初步反映该菌株利用底物的能力，完全可以作为菌种初筛的判断标准。如脂肪酶、淀粉酶、蛋白酶及核酸酶产生菌的分离，产有机酸菌的初筛。
例1：分离淀粉酶产生菌时，培养基以淀粉为惟一碳源，待样品涂布到平板上，经过培养形成单个菌落后，再用碘液浸涂，根据菌落周围是否出现透明的水解圈来区别产酶菌株。
例2：分离某种产生有机酸的菌株时，在培养基中添加碳酸钙。
变色圈法：对于一些不易产生透明圈产物的产生菌，可在底物平板中加入指示剂或显色剂，使所需微生物能被快速鉴别出来。
例：分离果胶酶产生菌，用含0.2%果胶为唯一碳源，菌落长成后加入0.2%的刚果红溶液染色4h，具有分解果胶能力的菌落周围便会出现降红色的变色圈。
抑菌圈法：若被检菌能分泌某些抑制工具菌生长的物质，如抗生素等，便会在该菌落的周围形成工具菌不能生长的抑菌圈，被鉴别出来。
常用于抗生素产生菌的分离。工具菌的选择是关键，工具菌采用抗生素的敏感菌。
生长圈法：常用于分离筛选氨基酸、核苷酸和维生素等产生菌。其工具菌是一些相对应的营养缺陷型菌株，由于得到所需的营养，凡是目的微生物周围便会出现一个混浊生长圈。
第三节 菌种选育
目的：防止菌种退化；解决生产实际问题；提高生产能力；提高产品质量；开发新产品。
优良的生产菌种应具备的基本特性： （1）菌种细胞的生长活力强； （2）生理性状稳定；
（3）纯、具有抗噬菌体感染的能力；
（4）稳定高产与目标产品性质相近的副产物及其他产物少； （5）能采用价格便宜，来源广泛的原料，并且转化效率高。
方法：自然选育、诱变育种、细胞工程育种（杂交育种、原生质体融合育种）、基因工程育种等。 一、自然选育
定义：不经人工处理，利用微生物的自然突变进行菌种选育的过程称为自然选育。 自然突变有两种情况：
一种是我们生产上所不希望看到的，表现为菌株的衰退和生产质量的下降，这种突变成为负突变。另一种是我们生产上希望看到的，对生产有利，这种突变成为正突变。
为了保证生产水平的稳定和提高，应经常地进行生产菌种自然选育，以淘汰退化的，选出优良的菌种。
自然选育在工业生产上的意义：
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自然选育是一种简单易行的方法，可达到纯化菌种、防止菌种退化、稳定生产、提高产量的目的。虽然其突变率很低，却是工厂保证稳产高产的重要措施。
二、诱变育种
人工利用各种诱变剂诱发基因突变，再通过适当的筛选方法获得所需要的优良菌种的育种方法，称为诱变育种。
诱变剂：能提高生物体突变频率的物质称为诱变剂。 诱变育种的理论基础是：基因突变 （一）诱变剂处理过程中几个有关的问题 1、化学诱变剂使用过程的安全性
2、出发菌株的选择
定义：出发菌株指用于诱变育种的最初菌株或每代诱变的试验菌株。 ★ 菌株要有一定的生产能力；
★ 生长繁殖快，营养要求低，产孢子多且早； ★ 对诱变剂敏感；
★ 对菌株产量，形态、生理等情况了解。
★ 多出发菌株：一般采用3~4个出发菌株，在逐代处理后，将产量高、特性好的菌株留作继续诱变的出发菌株。
3、诱变剂的选择
●考虑诱变剂的作用机理，根据实际操作方便或成功的经验；
●实践证明并非所有诱变剂对某个出发菌株都是有效的； ●诱变剂的诱变作用，还取决于出发菌株的特性及其诱变史。 4、诱变剂量的选择
剂量的大小常以致死率和诱变率来确定。
最适剂量是指能够提高正突变株变异频率幅度的诱变剂量。
处理剂量大，致死率高，诱变率也会提高，但达到一定程度后，再提高剂量反而会下降；但诱变剂量也不宜过低，否则很难获得所需的正突变株。 （二）诱变剂处理的方式 有以下三种：
（1）直接处理：将菌悬液用诱变剂直接处理，然后分离。
（2）生长过程处理：适用于诱变作用强而致死率低的诱变剂，或只在分裂过程中对DNA起作用的诱变剂，如秋水仙素。这些诱变剂一般都直接加入到培养基中，混匀，倒入平皿制成平板后培养，在生长过程中诱发菌体突变。
（3）振荡培养处理：即在摇瓶培养基中加入一定量的诱变剂。菌体随着振荡培养，不断地和诱变剂接触，它们之间的作用远比平板生长过程处理充分得多，所以诱变剂浓度不宜过高。 （三）诱变筛选流程 (致死率、突变率、正变率、高产率、投产率)
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长江大学生科院生物技术系 《发酵工程》讲义 （三）诱变筛选流程(致死率、突变率、正变率、高产率、投产率)出发菌种斜面单孢子悬液诱变处理稀释涂平板挑取单菌落200个或摇瓶培养24h留种保藏菌种细菌悬液摇瓶复筛5株挑出高产菌株传种斜面挑出高产斜面摇瓶初筛50株放大罐试验，中试考查大型投产试验（四）筛选的方法 ? 随机筛选 也称摇瓶筛选，具体做法是：将诱变处理后菌体分离到琼脂平板上，培养后随机挑选菌落，一个菌落移入一支斜面，然后一支斜面的菌体接入一个三角瓶，放置在摇床上振荡培养，根据所测定产物活性的高低，决定取舍。 该法缺点是盲目性大，在突变概率小的情况下，如果菌落挑取少了，很难筛选到理想的突变株。 ? 先平板菌落预筛，再摇瓶振荡培养复筛 大量菌落先经过平板预筛，保留5%~10%的预筛菌株（约200株），再进行摇瓶培养，复证被筛菌株的重演性，同时从200株中筛选出更高产量的突变株。 此法不仅减少了人力物力，缩短了周期，而且减少了盲目性，提高了筛选效率。 （五）几种诱变剂的使用方法 1、紫外线诱变 新鲜斜面菌种+生理盐水或缓冲液洗下→振荡→稀释菌悬液→取5ml菌悬液→无菌培养皿→磁力搅拌→15W30cm紫外灯（营养体3~5min，芽孢10min）照射→黑纸包好增殖培养→挑单菌落 2、化学诱变（以亚硝酸为例） 处理真菌孢子： 取孢子悬液2ml，加入1ml 0.1mol/L NaNO2溶液和1ml pH4.5醋酸缓冲液，27℃保温处理若干分钟（如10min）后，取出2ml加到10ml 0.07mol/L pH8.6的磷酸氢二钠缓冲液中，pH下降至6.8左右以后中止诱变。然后稀释涂平板，培养后挑单菌落进行选择。
3、航天育种
所谓航天育种是利用空间环境高真空、微重力和强辐射的特点，在宇宙射线的辐射作用下，使生物的遗传性状发生变异，从而选育出优良品种。
第三章 发酵培养基
教学目的：了解发酵培养基的要求、培养基的类型和功能；掌握发酵培养基中的碳源，氮源，无机盐和微量元素，生长因子、前体和产物促进剂；掌握发酵培养基的设计和优化方法。
教学重点、难点：工业上常用的糖类及不同碳源对发酵的影响及其选择；氮源的种类及对发酵的影响；无机盐使用时应注意的问题；前体使用的方法和用量；正交法设计和优化发酵培养基。
发酵培养基作用：促进产物的形成、满足菌体的生长 发酵培养基的要求:
① 培养基能够满足产物最经济的合成。 ② 发酵后所形成的副产物尽可能的少。
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③ 培养基的原料应因地制宜，价格低廉；且性能稳定，资源丰富，便于采购运输，适合大规模储藏，能保证生产上的供应。
④ 所选用的培养基应能满足总体工艺的要求，如不应该影响通气、提取、纯化及废物处理等。
第一节 培养基的类型及功能
培养基按其组成物质的纯度、状态、用途可分为三大类型。
一、按组成物质的纯度
合成培养基: 所用的原料其化学成分明确、稳定 天然培养基: 采用天然原料 ，其成分不那么“纯”
二、按状态
固体培养基：适合于菌种和孢子的培养和保存，也广泛应用于有子实体的真菌类，如香菇、白木耳等的生产。 半固体培养基：即在配好的液体培养基中加入少量的琼脂，一般用量为0.5%～0.8%，主要用于微生物的鉴定。
液体培养基：80%～90%是水，是发酵工业大规模使用的培养基。
三、按用途（从发酵生产应用考虑）
培养基按其用途可分为孢子（斜面）培养基、种子培养基和发酵培养基三种。
第二节 发酵培养基的成分及来源
一、碳源
1、作用
提供微生物菌种生长繁殖所需的能源和合成菌体所必需的碳成分；提供合成目的产物所必须的碳成分。 2、来源
糖类、油脂、有机酸、正烷烃
3、工业上常用的糖类 ① 葡萄糖
? 几乎所有的微生物都能利用葡萄糖 ? 但是过多会引起葡萄糖效应
工业上常用淀粉水解糖，但是糖液必须达到一定的质量指标
不同的制糖工艺生产的糖液质量差别很大
② 糖蜜
糖蜜主要含有蔗糖，总糖可达50%～75%。一般糖蜜分甘蔗糖蜜和甜菜糖蜜。 糖蜜使用的注意点：
除糖份外，含有较多的杂质，其中有些是有用的，但许多都会对发酵产生不利的影响，需要进行预处理。 例：谷氨酸发酵
有害物资：胶体成分（起泡、结晶）、钙盐（结晶）、生物素（发酵控制） 预处理：澄清→脱钙→脱除生物素 例：柠檬酸发酵
有害物质：铁离子含量高（导致异柠檬酸的生成） 预处理：预先加入黄血盐除铁 ③ 淀粉 、糊精
使用条件：微生物必须能分泌水解淀粉、糊精的酶类，经水解成单糖后再被吸收利用。
缺点：难利用；发酵液比较稠、一般>2.0%时加入一定的α-淀粉酶；成分比较复杂，有直链淀粉和支链淀粉等等。
优点：来源广泛、价格低廉；可以克服葡萄糖效应的弊端。
常用的淀粉为玉米淀粉、小麦淀粉和甘薯淀粉。
二、氮源
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氮源主要用于构成菌体细胞物质（氨基酸，蛋白质、核酸等）和含氮代谢物。常用的氮源可分为两大类：有机氮源和无机氮源。 1、无机氮源
种类：氨盐、硝酸盐和氨水
特点：微生物对它们的吸收快，所以也称之谓迅速利用的氮源。但无机氮源的迅速利用常会引起pH的变化如：(NH4)2SO4 → 2NH3 + 2 H2SO4 NaNO3 + 4H2 → NH3 + 2H2O + NaOH
无机氮源被菌体作为氮源利用后，培养液中就留下了酸性或碱性物质，这种经微生物生理作用（代谢）后能形成酸性物质的无机氮源叫生理酸性物质，如硫酸胺；若菌体代谢后能产生碱性物质的则此种无机氮源称为生理碱性物质，如硝酸钠。
正确使用生理酸碱性物质，对稳定和调节发酵过程的pH有积极作用。 所以选择合适的无机氮源有两层意义：
? 满足菌体生长
? 稳定和调节发酵过程中的pH
2、有机氮源
来源：工业上常用的有机氮源都是一些廉价的原料，花生饼粉、黄豆饼粉、棉子饼粉、玉米浆、玉米蛋白粉、蛋白胨、酵母粉、鱼粉、蚕蛹粉、尿素、废菌丝体和酒糟。
成分复杂：除提供氮源外，有些有机氮源还提供大量的无机盐及生长因子。 例 玉米浆，是一种很容易被微生物利用的良好氮源： ①含丰富的氨基酸、生长因子（生物素、苯乙酸） ②较多的乳酸
③丰富的硫、磷、微量元素等 氮源使用的一些相关问题：
? 有机氮源和无机氮源应当混合使用
? 有些产物会受氮源的诱导和阻遏
? 有机氮源选取时也要考虑微生物的同化能力
? 开发效果好、有针对性的有机氮源仍然是令人感兴趣的课题
三、无机盐和微量元素
P、Mg、S、Fe、K、Na、Pb、Cl、Zn、Co、Mn等无机盐和微量元素，作为酶的激活剂、生理活性物质的组成或生理活性作用的调节剂。低浓度时对细胞生长和产物的合成有促进作用，高浓度时表现显著抑制作用。
四、生长因子、前体和产物促进剂
1、生长因子
从广义上讲，凡是微生物生长不可缺少的微量的有机物质，如氨基酸、嘌呤、嘧啶、维生素等均称生长因子。 如以糖质原料为碳源的谷氨酸生产菌均为生物素缺陷型，以生物素为生长因子,生长因子对发酵的调控起到重要的作用 。
有机氮源是这些生长因子的重要来源，多数有机氮源含有较多的B簇维生素和微量元素及一些微生物生长不可缺少的生长因子
2、前体
前体指某些化合物加入到发酵培养基中后，能直接使微生物在生物合成过程中结合到产物分子中去，而其自身的结构并没有多大变化，但是产物的产量却因加入前体而有较大的提高。 作用：前体有助于提高产量和组份
用量：前体的用量可以按分子量衡算，具体使用有个转化率的问题 例：60000单位/ml的青霉素G，理论上需要多少苯乙酸？ 青霉素＝60000*0.6（微克）＝36mg/ml 苯乙酸＝（36*136）/356=13.8mg/ml 实际使用时的转化率在46-90%之间
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例某厂苯乙酸消耗为：0.337（kg/10亿单位青霉素）转化率为：？
用法：前体使用时普遍采用流加的方法 前体一般都有毒性，浓度过大对菌体的生长不利
前体相对价格较高，添加过多，容易引起挥发和氧化。
3、产物促进剂
所谓产物促进剂是指那些非细胞生长所必须的营养物，又非前体，但加入后却能提高产量的添加剂。
五、水
水源质量的主要考虑参数包括pH值、溶解氧、可溶性固体、污染程度以及矿物质组成和含量。
第三节 发酵培养基的设计和优化
一、成分含量的确定
１、理论转化率与实际转化率
理论转化率为培养基成分浓度的确定提供了重要的参考。
在发酵过程中如何控制实际转化率尽可能接近于理论转化率是发酵控制的一个目标。 ２、实验设计 ? 培养基成分和浓度的确定最终都是通过实验获得。 一般首先通过单因素实验确定培养基的各成分；再通过多因素实验确定各成分对培养基的影响大小及其适宜的浓度。 ? 合理的实验方法 多因素实验：均匀设计、正交实验设计、响应面分析等。
二、培养基设计的步骤 ① 根据前人的经验和培养基成分确定时一些必须考虑的问题，初步确定可能的培养基成分；
?初步确定可能的培养基成分(以碳源为例)② 通过单因素实验确定出最为适宜的培养基成分；
通过单因素实验确定适宜的培养基成分及浓度(以碳源为例)考虑到成本：乙酸钠是较为合适的碳源。500克丁二酸钠、柠檬酸钠和乙酸钠的售价分别为61. 2元、23元和13元。③ 当培养基成分确定后，剩下的问题就是各成分最适
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长江大学生科院生物技术系 《发酵工程》讲义 的浓度，由于培养基成分很多，为减少实验次数常采用一些合理的实验设计方法。 ? 正交实验优化培养基配方 第一步：确定因素水平表 第二步：选用合适的正交表，确定正交表头，并安排实验 L9(34)正交实验结果 第三步：根据正交表给出的方案，进行实验 第四步：对实验结果进行分析、验证 三、摇瓶水平到反应器水平的优化配方 摇瓶——培养基设计的第一步 反应器——最终的优化的基础配方 四、培养基设计时注意的一些相关问题 ? 原料及设备的预处理 ? 原材料的质量 ? 发酵特性的影响 在抗生素发酵生产中往往喜欢所谓的“稀配方”，因为它既降低成本、灭菌容易、且使氧传递容易而有利于目的产物的生物合成。如果营养成分缺乏，则可通过中间补料方法予以弥补。 ? 灭菌 第四章 种子的扩大培养
教学目的：了解种子扩大培养的目的和制备过程；掌握优良种子应具备的条件；掌握种子制备技术；了解谷氨酸和青霉素生产的种子制备。
教学重点、难点：发酵级数的确定及对发酵的影响；接种量的确定及对发酵的影响；影响种子质量的因素及其控制措施。
第一节 种子扩大培养的目的与要求
种子扩大培养的目的：
□ 接种量的需要
□ 缩短发酵时间、提高发酵效率 □ 菌种的驯化
优良种子应具备的条件：
? 菌体浓度及总量能满足大规模发酵罐接种量的要求 ? 生理状态稳定，如菌丝形态、菌丝生长速率等 ? 生长活力强，移种至发酵罐后，能够迅速生长 ? 无杂菌污染，保证纯种发酵
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? 菌种适应性强，能保持稳定的生产能力
第二节 种子制备技术概要
一、种子制备的过程
1－砂土孢子2—冷冻干燥孢子3－斜面孢子
4—摇瓶液体培养 5—茄子瓶斜面培养 6—固体培养基培养 7、8—种子灌培养 9—发酵罐
二、实验室阶段
1、培养物选择的原则
目的：种子扩培到一定的量和质
根据菌种的特点最终的培养物可分为两类：
（1）对于不产芽孢和孢子的微生物
实验室阶段的种子扩培最终是获得一定数量和质量的菌体，如谷氨酸的种子培养。 （2）对于产孢子的微生物
? 获得一定数量和质量的孢子：
对于产孢子能力强及孢子发芽、生长迅速的菌种可采用固体培养基培养孢子，所获孢子可直接作为种子罐的种子。
? 获得一定数量和质量的菌丝体：
对于产孢子能力不强及孢子发芽慢的菌种，可以采用摇瓶液体培养法，经恒温振荡培养获得菌丝体。 孢子的制备：
① 细菌孢子的制备
◆ 斜面培养基多采用碳源限量而氮源丰富的配方。 ◆ 培养温度：一般为37?C，少数28?C 。 ◆ 培养时间：需要5~10天。
② 霉菌孢子的制备
◇ 一般以大米、小米、玉米、麸皮、麦粒等天然农产品为培养基。 ◇ 培养的温度：一般为25~28?C。 ◇ 培养时间：4~14天。 ③ 放线菌孢子的制备
◆ 一般采用琼脂斜面培养基，培养基中含有一些适合产孢子的营养成分，如麸皮、豌豆浸汁、蛋白胨和一些无机盐等，C、N不要太丰富（碳源约为1%，氮源不超过0.5%）。 ◆ 培养温度：大多数为28?C，少数37?C 。 ◆ 培养时间：5~14天。
2、培养基选择的原则
培养基的选择应该是有利于菌体的生长，对孢子培养基有利于孢子的生长。
在原料方面，实验室种子培养阶段，规模一般比较小，因此为了保证培养基的质量，培养基的原料一般都比较精细。
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三、生产车间阶段
1、培养物的选择原则
在生产车间阶段，最终一般都是获得一定数量的菌丝体。
菌丝体比孢子要有利： ? 缩短发酵时间
? 有利于获得好的发酵结果
2、培养基选择的原则
目的：获得一定数量和质量的菌体，因此培养基的选择应首先考虑的是有利于孢子的发育和菌体的生长，所以营养要比发酵培养基丰富。
在原料方面：不如实验室阶段那么精细，而是基本接近于发酵培养基，这有两个方面的原因: 一是成本、二是驯化。
3、发酵级数的确定
一般由菌丝体培养开始计算发酵级数，但有时，工厂从第一级种子罐开始计算发酵级数。 谷氨酸：三级发酵
一级种子（摇瓶）→二级种子 （小罐）→发酵 青霉素：三级发酵（二级种子罐扩大培养）
一级种子 （小罐）→二级种子（中罐）→发酵 发酵级数确定的依据：
? 级数受发酵规模、菌体生长特性、接种量影响；
? 级数大，难控制、易染菌、易变异，管理困难，一般2～4级； ? 在发酵产品的生产中，反应级数的确定是非常重要的一个方面。
4、接种量的确定
接种量大小取决于生产菌种的生长繁殖速度。过大过小都不好，最终以实践定，如大多数抗生素为7～15%，而由北京棒状杆菌发酵谷氨酸只需1%。
但是一般认为大一点好。采用较大的菌种量可缩短菌丝体繁殖达到高峰的时间，使产物形成提前到来；但如果接种量过多，往往又会使菌丝生长过快，培养液黏度增加，造成溶解氧不足，而影响产物的合成。
近年来，生产多以加大种子量及采用丰富培养基作为获得高产的措施。有的产品采用双种法：两个种子罐接种到一个发酵罐中。如卡那霉素生产中采用双种比单种的发酵单位提高8%。也有的采用倒种法：一部分种子来源于种子罐，一部分来源于发酵罐中发酵液。如链霉素发酵，使用倒种比单种发酵单位提高12%。
5、种龄
种龄是指种子罐中培养的菌丝体开始移入下一级种子罐或发酵罐时的培养时间。
原则：一般以处于对数生长期的菌丝体较为合适，细胞活力强，菌体浓度相对较大。具体需实验确定。
四、种子质量控制
1、种子质量标准
①生化指标：检测培养液中的糖、氨基氮、磷酸盐含量、pH值的变化。 ②检查菌丝形态、菌丝浓度和培养液外观（色泽、气味、浑浊度等） ③检查有无杂菌污染 ④产物生成量
⑤其他参数：如某些酶的活力、种子罐的溶氧和尾气等。
2、影响种子质量的因素
①原材料质量
生产过程中经常会出现种子质量不稳定的现象，其主要原因是原材料质量波动：产地、品种、加工方法等。 ②种龄
种龄过于年轻的种子接入发酵罐后，往往会出现前期生长缓慢、泡沫多、发酵周期延长以及因菌体量过少而
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菌丝结团，引起异常发酵等等；而种龄过老的种子接入发酵罐后，则会因菌体老化而导致生产能力衰退。一般以对数生长期为好。
③培养条件
培养温度过低会导致菌种生长发育缓慢，过高会使菌种过早自溶。如果不是用最适温度培养，其生产能力就会下降。
选择最适种子培养pH；最后一级种子的培养基pH应接近于发酵培养基的pH，以便种子能尽快适应新的环境。
通气与搅拌：足够的通气量可提高种子质量；搅拌可以提高通气效果，但如果搅拌效果不好、搅拌时泡沫过多会使菌丝黏壁，甚至菌丝结团，影响种子质量。此外，丝状真菌，一般不宜剧烈搅拌。 ④斜面冷藏时间
对孢子的生产能力有较大的影响，通常冷藏时间越长，生产能力下降越多。 ⑤湿度
斜面培养基的湿度对孢子的质量有较大影响，湿度低孢子生长快，湿度高孢子生长慢。
3、种子质量的控制措施
（1）菌种稳定性的检查
定期考查和挑选菌种，对其进行自然分离，摇瓶发酵，测定生产能力，以不低于原有的生产能力为原则，从中挑选出高产菌株，并及时对退化菌种进行复壮。
（2）适宜的生长环境
确保菌种能在适宜的条件下生长繁殖，包括营养丰富的培养基、适宜的培养温度、pH和湿度、合理的通气量等。
（3）种子无杂菌检查
种子在制备过程中每一步移种均需进行无菌检查，并对种子液进行生化分析：主要是取样测定其营养消耗速度、pH变化、溶解氧利用情况、色泽和气味等。
无菌检查是判断杂菌的主要依据，通常采用镜检和无菌试验相结合。
４、种子质量异常分析
●菌种生长过慢或过快：与孢子质量及种子罐培养条件有关。 ●菌丝结团：与搅拌效果差，接种量小有关。
●菌丝粘壁：与搅拌效果不好，泡沫过多，以及种子罐装料系数过小等原因有关。
第三节 种子制备过程举例
一、谷氨酸生产的种子制备
制备过程：
斜面种子 → 摇瓶种子（一级种子）→ 种子罐种子（二级种子）
1、斜面种子
培养基：蛋白胨 1%，牛肉膏1%，氯化钠 0.5%琼脂 2%， pH 7.0-7.2 培养条件：32℃，生长18-24小时
培养基特点：有利于菌体的生长，原料比较精细
生长斜面要求：生长良好，所使用斜面连续传代不超过3次
2. 一级种子（摇瓶种子）
培养基：葡萄糖2%，尿素0.5%，玉米浆 2.5%，K2HPO4 0.1%
培养条件：于1000ml三角瓶中，装液200-250ml，32℃培养12小时。
培养基特点：有利于菌体的生长，所使用的原料已经基本接近于发酵培养基。 3. 二级种子(种子罐种子)
培养基：和一级种子相似，其中葡萄糖用水解糖代替，浓度为2.5%。 培养条件：在种子罐中培养（容积为发酵罐的1%），32℃培养7-10个小时。 培养基的特点：长菌体，更接近于发酵培养基。
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种子的质量要求：
89
★二级种子培养结束时要求活菌数为10-10个/ml ★菌体大小均匀，呈单个或八字排列 ★无杂菌及噬菌体感染
★活力旺盛
二、青霉素生产的种子制备
制备过程：
安培管 → 斜面孢子 → 大米孢子 → 一级种子（种子罐）→ 二级种子
1、斜面孢子
培养基：甘油、 葡萄糖、 蛋白胨等
培养条件：25℃、6～7天, 注意湿度50%左右 培养基特点：有利于长孢子，用量少而精细 2、大米孢子
培养基：大米及氮源（玉米浆）
培养条件：25℃、 6～7天，控制湿度
培养基的特点：成本低、米粒之间结构疏松提高比表面积和氧的传质，营养适当（要求大米的白点小）有利于孢子的生长。
大米孢子的要求：1粒米含1.4×106个孢子 3、一级种子（种子罐） 培养基：（葡萄糖、乳糖、蔗糖）、玉米浆 培养条件：27℃，40～45小时 接种量：200亿孢子/吨 目的：长菌体
4、二级种子（种子罐） 培养基：同上
培养条件：27℃、10 ～ 14小时 接种量：10%
第五章 发酵过程控制
发酵过程控制是发酵的重要部分。
控制难点：过程的不确定性和参数的非线性
第一节 发酵过程工艺控制的目的、
研究的方法和层次
教学目的：了解发酵过程的种类、控制的目的以及研究的方法和层次；掌握发酵过程的中间分析。 教学重点、难点：发酵代谢（状态）参数的分类；产物量的特殊表示法及其测定方法。
一、发酵过程的种类
分批培养、补料分批培养、半连续培养、连续培养
二、发酵过程控制的目的
有一个好的菌种以后要有一个配合菌种生长的最佳条件，使菌种的潜能发挥出来。 目标是得到最大的比生长速率和最大的生产率。
发挥菌种的最大生产潜力考虑之点：
? 菌种本身的代谢特点：生长速率、呼吸强度、营养要求、代谢速率
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? 菌代谢与环境的相关性：温度、pH、渗透压、离子强度、溶解氧浓度、剪切力等
三、发酵过程研究的方法和层次
1、研究方法
单因素实验：对实验中要考察的因素逐个进行试验，寻找每个因子的最佳条件。一般用摇瓶做实验。
数理统计学方法：运用统计学方法设计实验和分析实验结果，得到最佳的实验条件。如正交设计、均匀设计、响应面设计。
2、研究的层次
初级层次的研究：
一般在摇瓶规模进行试验。主要考察目的菌株生长和代谢的一般条件，如培养基的组成、最适温度、最适pH等要求。
代谢及工程参数层次研究：
一般在小型反应器规模进行试验。
生产规模放大：
在大型发酵罐规模进行试验。将小型发酵罐的优化条件在大型反应器上得以实现，达到产业化的实现。
第二节 发酵过程的中间分析
代谢参数按性质分可分三类：
物理参数：温度、搅拌转速、罐压、空气流量、溶解氧、泡沫、表观粘度、排气氧（二氧化碳）浓度等
化学参数：基质浓度（包括糖、氮、磷）、pH、产物浓度、核酸量等
生物参数：菌丝形态、菌浓度、菌体比生长速率、呼吸强度、基质消耗速率、关键酶活力等 从检测手段分又可分为：直接参数、间接参数
直接参数：通过仪器或其它分析手段可以测得的参数，如温度、pH、搅拌转速、残糖等 间接参数：将直接参数经过计算得到的参数，如菌体比生长速率、摄氧率、 KLa等
直接参数又可分为: 在线检测参数和离线检测参数
在线检测参数：不经取样直接从发酵罐上安装的仪表上得到的参数，如温度、pH、搅拌转速、泡沫等； 离线检测参数：指取出样后测定得到的参数，如残糖、NH2-N、菌体浓度等。
一、发酵过程主要分析的项目
1、pH
pH与微生物的生命活动密切相关——酶催化活性。
pH的变化又是微生物代谢状况的综合反映——细胞状态、产物合成、营养状况、供氧状况等。
2、尾气氧、尾气CO2和呼吸熵
尾气氧的浓度表征了进气的氧被微生物利用以后还剩余的氧，因此尾气氧的大小反映了菌生长的活性，通过计算可以求得摄氧率（OUR）。 尾气二氧化碳反映了微生物代谢的情况，因为微生物摄入的氧并不是全部变成二氧化碳的，有的进入代谢中间物分子，进入细胞或产物，因此消耗的氧并不等于排出的二氧化碳，此外，含氧的有机物降解后会产生二氧化碳，使排气二氧化碳大于消耗的氧。
CO2释放速率（CER）：表示单位体积发酵液单位时间内释放的二氧化碳的量。 摄氧率(r或OUR)：单位时间内单位体积的发酵液所需要的氧量。mmol ·L-1·h-1
RQ?CEROUR呼吸熵反映了氧的利用状况。
3、糖含量
微生物生长和产物合成与糖代谢有密切关系。
糖的消耗：反映产生菌的生长繁殖情况，反映产物合成的活力
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糖含量测定包括总糖和还原糖。
总糖：指发酵液中残留的各种糖的总量。如发酵中的淀粉、饴糖、单糖等各种糖。 还原糖：指含有自由醛基的单糖，通常指的是葡萄糖。
4、氨基氮和氨氮
氨基氮：指有机氮中的氮（NH2-N），单位是 mg/100ml。如氨基酸中的氮，黄豆饼粉、花生饼粉中都有有机氮。
氨氮：指无机氨中的氮（NH3-N）
氮利用快慢可分析出菌体生长情况，含氮产物合成情况。
5、磷含量
磷是核酸的组成部分，是高能化合物ATP的组成部分，磷还能促进糖代谢。因此磷在培养基中具有非常重要的作用，如果磷缺乏就要采取补磷措施
6、菌体浓度和菌体形态
菌体形态和菌体浓度直接反映菌生长的情况。
7、产物浓度
二、产物量的测定
（一）产物量的特殊表示法
1、抗生素效价的表示
抗生素效价表示抗生素的有效成分的多少，效价大小用单位（U）来表示。
效价表示方法：重量折算法、重量单位、类似重量单位、特殊单位
重量折算单位：以最低抑菌浓度为单位，如青霉素0.6微克＝1U
重量单位：规定某些抗生素活性部分1μg=1u，如链霉素、卡那霉素、红霉素等。
类似重量单位：规定抗生素的某种盐1mg=1000u，如金霉素、四环素的盐酸盐，定义1μg＝1u。 特殊单位：药检所制定某些抗生素的单位：制霉菌素 1mg=3700u；多粘菌素B 1mg=10000u
2、酶活力的表示法
国际上作了统一规定，规定在25℃下，以最适的底物浓度，最适的缓冲液离子强度，以及最适的pH诸条件下，每分钟能转化一微克分子底物的酶定量为一个活性单位。 （二）产物量的测定 1、化学法
（1）滴定法
产物能使一定指示剂变色来指示反应终点的可用滴定法。
（2）比色法
产物经一定化学反应产生颜色，且颜色深浅与产物浓度成正比，可以用比色法测定。 （3）测压法
产物特定反应放出或摄入气体，使系统有压力变化，可以通过测定压力变化得知产物量。
2、物理法
许多酶、抗生素都有不对称碳原子，具有旋光性，因此可以通过测定旋光度来测定酶或抗生素的含量。 3、生物法
适用于抗生素效价的测定。
第三节 氧的供需及控制
教学目的: 了解描述微生物需氧的物理量、影响需氧的因素，掌握溶解氧浓度对菌体生长和产物形成的影
响、发酵过程中溶解氧的变化和溶解氧的控制，理解溶解氧和pH综合控制系统。
教学重点、难点：临界溶解氧浓度、溶解氧浓度对产物形成的影响、发酵过程中溶解氧的变化、提高KLa的途径、溶解氧的控制、溶解氧和pH综合控制系统。
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一、描述微生物需氧的物理量
比耗氧速率或呼吸强度（QO2 ）：单位时间内单位重量的细胞(干重)所消耗的氧气，mmolO2/(g菌·h ) 摄氧率(r)：单位时间内单位体积的发酵液所需要的氧量。mmolO2·L-1·h-1 。 r= QO2 .X X——细胞浓度（g/L)
二、影响需氧的因素 ◆ 菌体浓度：直接影响培养液的摄氧率。 ◆ QO2:呼吸强度又受到很多因素影响 ? 遗传因素 ? 菌龄 ? 代谢类型 ? 培养基的成分与浓度： 培养基成分尤其是碳源对细胞的耗氧量有很大影响。 培养基的浓度也会影响细胞的耗氧速率。 ? 发酵条件：温度、pH通过对酶活性的影响而影响菌体细胞的耗氧，而且温度还影响发酵液的 溶氧浓度。此外有些有害物质的积累，如NH3、CO2，会抑制微生物的呼吸。
三、溶氧浓度对菌体生长和产物形成的影响 QO2CCrCL（溶解氧浓度）CCr：呼吸临界氧浓度, 指不影响呼吸所允许的最低溶氧浓度。如果对产物而言，便是不影响产物合成所允许的最低浓度。 一般对于微生物： CCr: ＝1～25%饱和浓度 例：酵母 4.6*10-3mmol.L-1, 1.8% 产黄青霉 2.2*10-2mmol.L-1, 8.8% 注意：有时产物合成临界氧浓度和菌体生长所需的呼吸临界氧浓度会不一样。
溶解氧浓度对菌体生长和产物的形成会产生不同的影响。
如，谷氨酸、精氨酸和脯氨酸发酵时，若供氧不足，其积累就会明显降低，产生大量乳酸和琥珀酸。 但在培养过程中并不是维持溶氧越高越好。即使是专性好氧菌，过高的溶氧对生长可能不利。
如，亮氨酸、缬氨酸和苯丙氨酸，仅在供氧受限、细胞呼吸受抑制时，才能获得最大量的氨基酸，如果供氧充足，产物形成反而受到抑制。 而异亮氨酸、赖氨酸、苏氨酸和天冬氨酸，供氧充足可得最高产量，但供氧受限产量受影响并不明显。
四、发酵过程中溶解氧的变化 第 18 页
长江大学生科院生物技术系 《发酵工程》讲义 在发酵过程中，在已有设备和正常发酵条件下，每种产物发酵的溶氧变化都有自己的规律。 在发酵过程中，有时出现溶氧明显降低或明显升高的异常变化，常见的是溶氧下降。 引起溶氧异常下降，可能有下列几种原因： ①污染好气性杂菌； ②菌体代谢发生异常现象，需氧要求增加； ③某些设备或工艺控制发生故障或变化。 引起溶氧异常升高的原因，在供氧条件没有发生变化的情况下，主要是耗氧出现改变。 五、反应器中氧的传递 （一）发酵液中氧的传递方程： Na?kLa(c*?c) （二）供氧的调节 可以通过kLa和C*来调节。调节kLa是最常用的方法，它反映了设备的供氧能力。 1、影响摇瓶kLa的因素：为装液量和摇瓶机的种类 2、影响发酵罐中kLa的因素
（1）设备参数：发酵罐的形状结构、搅拌器（直径d）、挡板、空气分布器等。
（2）操作条件：通气量Q、搅拌转速N、搅拌功率PG、罐压、发酵液体积V、液柱高度HL等。 （3）发酵液的性质：密度、黏度、表面张力和扩散系数等。 （4）氧载体
氧载体提高KLa：通过在发酵液中引入一种新的液相，以减少气液传氧阻力，从而提高传氧效率。这种液相一般具有比水更高的溶氧能力，且与发酵液互不相溶，称为氧载体。通常使用的氧载体主要有:液态烷烃、油酸、甲苯、豆油等。
六、发酵过程中溶解氧的控制
溶氧控制的一般策略：前期大于临界溶氧浓度有利于菌体生长，中后期满足产物的形成。
一般认为，发酵初期较大的通风和搅拌而产生过大的剪切力，对菌体的生长有时会产生不利的影响，所以有时发酵初期采用小通风，停搅拌，不但有利于降低能耗，而且在工艺上也是必须的。但是增大通气的时间一定要把握好。
溶氧控制在发酵过程控制中的应用：
国内外都有将溶氧、pH和补糖综合控制用于青霉素发酵的成功例子。控制的原则是加糖速率应正好使培养物处于半饥饿状态，即仅能维持菌的正常生理代谢，而把更多的糖用于产物的合成，并且其摄氧率不至于超过设备的供氧能力KLa。
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长江大学生科院生物技术系 《发酵工程》讲义 氧浓度100%饱和pH6.6要降低pH就需加更多的糖，这样又会使溶氧下降到低于控制点。要维持原来的氧控制点又要加强通气搅拌或增加罐压。要升高pH恰好相反。5.8氧浓度100%饱和KLa因子推动溶氧上升+5%补糖阀开大氧控制点总摄氧率驱动溶氧下降加糖阀－5%补糖阀关小其加糖阀由控制器操纵。当培养液的溶氧高于控制点时，加糖阀开大，糖的利用需要消耗更多的氧，导致溶氧读数下跌；反之，加糖速率便自动减小，摄氧率也会随之降低，引起溶氧读数逐渐上升。增KLa控制系统：1、搅拌转速2、通气速率3、罐压补糖速率增读数减氧控制点读数减图溶氧和pH综合控制系统图溶氧在加糖控制中的应用2008年2月12日星期二这种控制系统是按溶氧、KLa因子和菌的需氧之间的变化来决定补糖速率的增减。而KLa是按pH的趋势来调节的。 第四节 温度变化及其控制 教学目的：了解温度对微生物生长及发酵的影响；理解利用温度控制提高产量的实际应用；掌握发酵温度的选择、影响发酵温度变化的主要因素：发酵热。 教学重点、难点：发酵温度的选择；发酵热。 一、温度对生长的影响 每种微生物对温度的要求可用最适温度、最高温度、最低温度来表征。 二、温度对发酵的影响与控制 （一）温度对发酵的影响 1、温度影响反应速率 2、温度会改变发酵液的理化性质 如，影响基质溶解度、氧的溶解度，也影响菌体对某些基质的分解吸收，间接影响产物的合成。 3、温度影响生物合成的方向
如，四环素发酵生产菌金色链霉菌可同时产生金霉素和四环素，当温度低于30℃时，合成金霉素能力较强；温度提高，合成四环素的比例也提高，温度达到35℃时，金霉素的合成几乎停止，只产生四环素。
（二）最适温度的选择
1、根据菌种不同选择
微生物种类不同，所具有的酶系及其性质不同，所要求的生长温度范围也不同。如，黑曲霉最适生长温度为37℃；谷氨酸产生菌棒状杆菌的最适生长温度为30～32℃；青霉菌最适生长温度为30℃。
2、根据发酵阶段选择：即二阶段发酵
如黑曲霉生长37℃，产糖化酶32～34℃；谷氨酸产生菌生长30～32℃，产酸34～37℃；黄原胶发酵前期的生长温度控制在27℃，中后期32℃，比恒温发酵产量可提高约20%。 3、根据培养条件选择
温度选择还要根据培养条件综合考虑，灵活选择。
通气条件差时可适当降低温度，可使菌呼吸速率降低些，氧溶解浓度也相应髙些。 培养基稀薄或较容易被利用时，温度也该低些。因为温度高营养往往过早耗竭，导致菌过早自溶，产量降低。 4、根据菌生长情况 菌生长快，维持在较高温度时间要短些；菌生长慢，维持较高温度时间可长些。培养条件适宜，如营养丰富，通气能满足，那么前期温度可髙些，以利于菌的生长。
总的来说，温度的选择根据菌种生长阶段及培养条件综合考虑。要通过反复实践来定出最适温度。
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三、影响发酵温度变化的因素
（一）发酵热Q发酵
发酵热是引起发酵过程温度变化的原因。
所谓发酵热就是发酵过程中释放出来的净热量。在发酵过程中产生菌分解基质产生热量、机械搅拌产生热量、通气热，而罐壁散热、水分蒸发、空气排气带走热量。这各种产生的热量和各种散失的热量的代数和就叫做净热量。
1、生物热Q生物
在发酵过程中，菌体不断利用培养基中的营养物质，将其分解氧化而产生的能量，其中一部分用于合成高能化合物（如ATP）提供细胞合成和代谢产物合成需要的能量，其余一部分以热的形式散发出来，这散发出来的热就叫生物热。
? 生物热与发酵类型有关
? 培养过程中生物热的产生具有强烈的时间性。 2、搅拌热Q搅拌
搅拌热与搅拌轴功率有关，可用下式计算：
Q搅拌＝P×860×4186.8（焦耳/小时） P——搅拌轴功率
4186.8——机械能转变为热能的热功当量 3、通气热Q通气
4、蒸发热Q蒸发
通气时，引起发酵液的水分蒸发，水分蒸发所需的热量叫蒸发热。此外，排气也会带走部分热量叫显热Q显热，显热很小，一般可以忽略不计。
5、辐射热Q辐射
辐射热的大小取决于罐温与环境的温差。冬天大一些，夏天小一些，一般不超过发酵热的5％。
Q发酵＝Q生物＋Q搅拌＋ Q通气－Q蒸发－Q辐射 （二）发酵热的测定
有二种发酵热测定的方法。一种是用冷却水进出口温度差计算发酵热。在工厂里，可以通过测量冷却水进出口的水温，再从水表上得知每小时冷却水流量来计算发酵热。
Q发酵＝GCm(T出－T进)
Cm——水的比热 G——冷却水流量
另一种是根据罐温上升速率来计算。先自控，让发酵液达到某一温度，然后停止加热或冷却，使罐温自然上升或下降，根据罐温变化的速率计算出发酵热。
四、利用温度控制提高产量
例 利用热冲击处理技术提高发酵甘油的产量
第五节 发酵过程的pH控制
教学目的：了解发酵过程pH变化的原因；掌握pH对发酵的影响；掌握pH的控制策略。
教学重点、难点：pH对发酵的影响及发酵不同阶段pH有不同影响；pH的控制策略，特别是如何分阶段控制pH。
一、发酵过程pH变化的原因
1、基质代谢
（1）糖代谢：特别是快速利用的糖，分解成小分子酸、醇，使pH下降。糖缺乏，pH上升，是补料的标志之一。 （2）氮代谢：当氨基酸中的-NH2被利用后pH会下降；尿素被分解成NH3，pH上升，NH3利用后pH下降，当
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碳源不足时氮源当碳源利用pH上升。 （3）生理酸碱性物质利用后pH会上升或下降
2、产物形成
某些产物本身呈酸性或碱性，使发酵液pH变化。如有机酸类产生使pH下降，红霉素、洁霉素、螺旋霉素等抗生素呈碱性，使pH上升。
3、菌体自溶，pH上升；发酵后期，pH上升。
二、pH对发酵的影响
1、实例：pH对林可霉素发酵的影响
林可霉素发酵开始，葡萄糖转化为有机酸类中间产物，发酵液pH下降，待有机酸被生产菌利用，pH上升。若不及时补糖、(NH4)2SO4或酸，发酵液pH可迅速升到8.0以上，阻碍或抑制某些酶系，使林可霉素增长缓慢，甚至停止。
2、pH对发酵的影响
（1）pH影响酶的活性
（2）pH值影响微生物细胞膜所带电荷的改变，从而改变细胞膜的透性，影响微生物对营养物质的吸收及代谢物的排泄，因此影响新陈代谢的进行。
（3）pH值影响培养基某些成分和中间代谢物的解离，从而影响微生物对这些物质的利用 。
（4）pH影响代谢方向
pH不同，往往引起菌体代谢过程不同，使代谢产物的质量和比例发生改变。例如黑曲霉在pH2~3时发酵产生柠檬酸，在pH近中性时，则产生草酸。
谷氨酸发酵，在中性和微碱性条件下积累谷氨酸，在酸性条件下则容易形成谷氨酰胺和N-乙酰谷氨酰胺。 3、pH在微生物培养的不同阶段有不同的影响 4、最佳pH的确定
配制不同初始pH的培养基，摇瓶考察发酵情况
三、pH的控制策略
1、调节好基础料的初始pH。
2、在基础料中加入维持pH的物质，如CaCO3 ，或具有缓冲能力的试剂，如磷酸缓冲液等。 3、通过补料调节pH
在发酵过程中根据糖氮消耗需要进行补料。在补料与调pH没有矛盾时采用补料调节pH。 如（1）调节补糖速率，调节空气流量来调节pH。
(2) 当NH2-N低，pH低时补氨水；当NH2-N低，pH高时补(NH4)2SO4。
通过补料调节PH值既调节了培养液的PH值，又可补充营养，进一步提高发酵产率。 4、当补料与调pH发生矛盾时，加酸碱调pH 5、不同调pH方法的影响
6、发酵的不同阶段采取不同的pH值
第六节 发酵过程泡沫的形成与控制
教学目的：了解泡沫形成的原因及对消泡剂的要求；掌握发酵过程中泡沫消长的规律、起泡的危害及消泡剂的种类、性能和使用。
教学重点、难点：起泡的危害性；消泡剂与破泡剂的区别；消泡剂的种类及使用方法。
发酵过程起泡的利弊：因通气搅拌、产生CO2以及发酵液中糖、蛋白质等稳定泡沫的物质的存在，使发酵液含有一定量的泡沫，这是正常现象。少量泡沫可增加气液接触面积，有利于氧的传递，但过多的泡沫是有害的。
泡沫的定义：一般来说，泡沫是气体在液体中的粗分散体，属于气液非均相体系。
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一、泡沫形成的原因
1、气液接触 2、含助泡物
在纯净的气体、纯净的液体之外，必须存在第三种物质，才能产生气泡。对纯净液体来说，这第三种物质是助泡物。
3、起泡速度高于破泡速度
二、发酵过程中泡沫消长的规律
（1）通气搅拌的强烈程度 （2）培养基配比与原料组成
培养基营养丰富，黏度大，产生泡沫多而持久。
另外，培养基中的玉米浆、蛋白胨、花生饼粉、黄豆饼粉、酵母粉、糖蜜等是起泡的主要因素。 （3）菌种质量和接种量
菌种质量好，生长速度快，可溶性氮源较快被利用，泡沫产生几率也就少。菌种生长慢的可以加大接种量。 （4）灭菌质量
培养基灭菌质量不好，糖氮被破坏，抑制微生物生长，使种子菌丝自溶，产生大量泡沫，加消泡剂也无效。 （５）发酵过程中发酵液随菌的代谢活动不断变化，是泡沫消长的重要因素
三、起泡的危害
1、降低生产能力
在发酵罐中，为了容纳泡沫，防止溢出而降低装液量，装料系数一般取0.7。 2、引起原料浪费 3、影响菌的呼吸 4、引起染菌
四、泡沫的控制
泡沫的控制途径：
① 调整培养基的成分或改变某些物理化学参数或者改变发酵工艺来控制，以减少泡沫形成的机会。但效果有限。
②选育在生长期不产泡沫的微生物突变株。如有人已用杂交育种方法选育出不产泡沫的土霉素菌株。 ③机械消泡
④化学消泡：加消泡剂，当今发酵工业中常用的方法。 （一）机械消泡
靠机械力引起强烈振动或者压力变化，促使泡沫破裂。消泡装置可放在罐内或罐外，罐内最简单的就是在搅拌轴上方安装消泡浆，泡沫借旋风离心场压制；罐外消泡就是将泡沫引出罐外，通过喷嘴的加速作用或离心作用来消除泡沫。
优点：不需引进外界物质如消泡剂，可减少培养液性质复杂化的程度，也可节省原料，减少染菌机会；
缺点：效果不理想，仅可作为消泡的辅助方法，可和化学消泡法同时使用。 （二）消泡剂消泡
1、破泡剂与抑泡剂的区别
（1）消泡剂可分为破泡剂和抑泡剂
破泡剂是加到已形成的泡沫中，使泡沫破灭的添加剂。如低级醇、天然油脂。一般来说，破泡剂都是其分子的亲液端与起泡液亲和性较强，在起泡液中分散较快的物质。这类消泡剂随着时间的延续，迅速降低效率，并且当温度上升时，因溶解度增加，消泡效率会下降。
抑泡剂是起泡前预先添加而阻止起泡的添加剂。聚醚及有机硅等属于抑泡剂。一般是其分子与起泡液亲和性很弱的难溶或不溶的液体。
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（2）作用机理上的区别
破泡剂的破泡机理大致有二种：
第一，吸附助泡剂，加入电解质瓦解泡沫双电层，及使助泡剂被增溶等机理，这样就破坏助泡剂的稳泡作用。在这些过程中消泡剂发挥一次消泡作用就被消耗。同时消耗掉相应的助泡剂。
第二，低级醇等溶解性较大的消泡剂，加到气泡液中局部降低表面张力，发挥破泡作用，同时本身不断破为碎块，陆续溶解而失去破泡作用。
抑泡机理：一般认为抑泡剂分子在气液界面上优先被吸附，它比助泡剂的表面活性更强，更易吸附到泡膜上，但是由于本身不赋予泡膜弹性，所以不具备稳泡作用。这样当液体中产生泡沫时，抑泡剂首先占据泡膜，抑制了助泡剂的作用，抑制了气泡。 （3）破泡剂与抑泡剂的相互关系
溶解度大的破泡剂，消泡作用只发挥一次；溶解度小的破泡剂，消泡作用可持续一段时间。如果溶解度进一步降低，即成为抑泡剂。另一方面，破泡剂大量使用，会有抑泡作用，抑泡剂大量使用也会有破泡作用。 2、对消泡剂的要求 （1）在起泡液中不溶或难溶 （2）表面张力低于起泡液
（3）与起泡液有一定程度的亲和性 （4）与起泡液不发生化学反应
（5）挥发性小，作用时间长。
（6）无毒、对人畜无害，不影响生物合成。
（7）能耐高压蒸汽灭菌而不变性，在灭菌温度下对设备无腐蚀性或不形成腐蚀性产物。 3、常用消泡剂的种类和性能 （1）天然油脂
天然油脂是最早用的消泡剂，它来源容易，价格低，使用简单，一般来说没有明显副作用，如豆油、菜油、鱼油等，除了用作消泡外，还可作为碳源和中间补料用。油脂主要成分是高级脂肪酸酯和高级一元醇酯，还有高级醇、高级烃等。
A、酒糟榨出液
经分析证明，酒糟榨出液中存在C8～C18的全部脂肪酸，存在极性类脂物，尤其是卵磷脂等物，这些物质的协同作用下的消泡作用比这些物质单独消泡作用强得多。
B 、啤酒花油
研究发现向啤酒添加1～5ppm啤酒花油是减轻气泡溢出损失的有效措施。分析啤酒花油具有消泡活性的物质有：石竹烯、荷兰芹萜烯、香叶烯和蒎烯等。 （2）聚醚类消泡剂
六十年代发明此类消泡剂，美国道康宁化学公司首先投产。聚醚类消泡剂种类很多，常用的主要是：聚氧丙烯甘油（GP型消泡剂） ，用于链霉素发酵，代替天然油，加入基础料，效果很好；聚氧乙烯氧丙烯甘油（GPE型消泡剂）。它们以一定比例配制的消泡剂叫泡敌，用量为0.03% ～ 0.035%，用于四环素发酵效果很好，相当于豆油的10～20倍。
GP型消泡剂亲水性差，在发泡介质中的溶解度小，所以宜使用在稀薄的发酵液中。它的抑泡能力比消泡能力优越，适宜在基础培养基中加入，以抑制整个发酵过程的泡沫产生。
GPE型消泡剂亲水性较好，在发泡介质中易铺展，消泡能力强，但溶解度也较大，消泡活性维持时间短，因此用在粘稠发酵液中效果较好。
（3）高碳醇
高碳醇是强疏水弱亲水的线型分子，在水体系里是有效的消泡剂。七十年代初前苏联学者在阴离子、阳离子、非离子型表面活性剂的水溶液中试验，提出醇的消泡作用，消泡能力与它在起泡液中的溶解度及扩散程度有关。 （4）硅酮类
最常用的是聚二甲基硅氧烷，也称二甲基硅油。它表面能低，表面张力也较低，在水及一般油中的溶解度低且活性高。纯粹的聚二甲基硅氧烷，不经分散处理难以作为消泡剂。因此将硅油混入分散剂SiO2气溶胶中，构
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成复合物，即将疏水处理后的SiO2气溶胶混入二甲基硅油中，经一定温度、一定时间处理，就可制得。 4、消泡剂的使用
（1）消泡剂使用的增效方法
A、加载体增效：即用惰性载体（如矿物油、植物油）使消泡剂溶解分散，达到增效的目的。
B、消泡剂并用增效：如GP:GPE=1:1的泡敌用于土霉素发酵，结果比单用GP的效力提高2倍。
C、乳化消泡剂增效：用乳化剂将消泡剂制成乳剂，以提高分散能力，增强消泡效力，一般只用于亲水性差的消泡剂。如GP用土温80制成的乳剂，用于庆大霉素发酵，效力提高了1～2倍。 （2）消泡作用的持久性与加入量和加入时机有密切关系
同样用量的消泡剂少量多次的持久效果与少次多量的大不一样。少量多次或滴加可以收到有效防止泡沫产生和节省用量的双重效果。
（3）天然油脂的使用
注意一次不能加得太多，过多的油脂会使溶氧大幅度下降（这时加强供氧可减轻这种不利作用），还会被脂肪酶等分解为各种有机酸、脂肪酸等使pH 降低等。另外，油脂还会与铁形成过氧化物，对某些抗生素如四环素、卡那霉素等的生物合成有不良影响。
第七节 中间补料及其控制
教学目的: 了解中间补料的原因、优缺点，掌握中间补料的意义、原则及控制。 教学重点、难点：中间补料补什么？怎么补（补糖时间、补糖量、补料方式）？ 中间补料的原因：
●中后期营养不足，菌体过早衰老
●初始培养基营养过于丰富造成菌浓过大而缺氧 ●初始培养基中葡萄糖过多引起抑制 ●代谢后碳氮源不平衡、微量元素缺乏 ●合成产物或中间产物积累的毒性
一、中间补料的意义及原则
? 意义：控制菌的生长速率以及培养中期的代谢活动，延长合成期，推迟菌体自溶。另外，加入前体增加合成产物的中间体，从而使产量大幅度提高。
? 原则：控制和引导产生菌在培养过程中，特别是中后期的生化代谢活动向着有利于产物积累的方向发展。
二、补料控制
1、补充微生物所需的能源和碳源物质
发酵过程中，能源是从碳源来的。碳源是菌体需要量最大的物质，在发酵前期消耗很快，到了产物合成阶段菌体要维持活性必须补充碳源，以便延长产物合成期。 补糖控制考虑：补糖时间、补糖量、补糖方式
参考数据：糖耗速率、残糖浓度、pH变化、菌体浓度、菌丝形态、发酵液黏度、溶氧浓度等。一般选择其中两到三个参数来考虑。
常用的两个参考指标：还原糖水平和总糖水平。
? 补糖时间
补糖时间控制很重要，过早会刺激菌体生长，加速糖的消耗，不利于合成产物；过迟所需能量供应不上菌体已老化，合成产物的能力本身都很低了。
?补糖量
补糖量的控制，以控制菌体浓度不增或略增为原则，使产生菌的代谢活动有利于产物合成。一般在补糖开始阶段控制还原糖在较高水平，以利于产物合成，但高浓度的还原糖不宜维持过久，否则会导致菌体大量繁殖影响产物的合成。
?补料方式
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长江大学生科院生物技术系 《发酵工程》讲义 补料方式可分为：连续流加、不连续流加（少量多次、大量少次）和多周期流加 每次流加又可分为：快速流加、恒速流加、指数速率流加、变速流加。 不同补料方式对L-缬氨酸发酵的影响补糖方式L-缬氨酸（g/L）一次定量间歇定量间歇恒速流加45.9848.9451.98菌体浓度对葡萄糖的残糖浓度（g/L）转化率（g/L）（%）16.216.717.330.6532.6334.659.24.91.8不同补料方式，菌体浓度相差不大，但葡萄糖转化率相差较大。这说明什么问题？2、补充微生物所需的氮源 补氮是发酵控制的另一个重要项目，主要作用是调节pH 和补充产生菌所需的氮源，从而控制代谢活动。 生产上补氮有两种：◆ 补充有机氮源 ◆ 补充无机氮源：通氨、补硫酸铵 （1）补充有机氮源 添加某些具有调节生长代谢的有机氮源，如尿素、酵母粉、蛋白胨、玉米浆，保持菌的活性，补充产物合成所需的氮源。 补料依据：氨基氮的消耗、菌的浓度、pH变化。 根据pH变化补氮源pH尿素时间在谷氨酸生产中，尿素作为氮源时首先被菌体的脲酶分解变成氨，使pH上升。前12h为菌体生长阶段，由于菌体生长快，氨被利用，使pH下降，这时要及时流加尿素，供给菌体生长所需的氮源并调节pH。生产阶段菌生长停止，尿素先被脲酶分解为氨，使pH上升，氨被利用来合成谷氨酸，使pH下降，再次流加尿素。（2）补无机氮源 通氨：通氨是某些抗生素提高产量的有效措施，它的作用是补充无机氮源和调节pH。 补硫酸铵 补氮控制：补氮时间、补氮量、补氮方式 补充黄豆饼粉、酵母粉一般采取分批补料，而无机氮源和尿素一般采取流加方式，因为这些氮源对pH的影响大，而且过多的氨离子会对菌的生长产生抑制作用。 当同时需补碳源和氮源时，可混合起来一起加入。 补料浓度的确定可以以摇瓶的基质残留浓度为依据进行试验。 3、补前体 在发酵过程中添加前体可以显著增加产量及控制发酵方向。但要注意前体量过大会产生毒性。 4、补水、无机盐和微量元素 当发酵液过于粘稠时补水或补稀料可以稀释发酵液，增加氧的溶解度，提高供氧能力。 第 26 页 长江大学生科院生物技术系 《发酵工程》讲义
有些金属离子特别是二价阳离子是酶的激活剂，适当时间补入无机盐，可以提高酶活，从而提高产量。
三、中间补料的优缺点
优点：推迟菌体自溶期，延长产物分泌期，维持较高的生产速率，提高产量。
缺点：补料使工艺复杂化，而且增加了染菌机会。因此工厂管理十分重要，一定要严格消毒，包括补充料液的消毒和管道消毒。
第六章 抗生素生产工艺
教学目的:了解抗生素的定义、分类，掌握抗生素生产工艺过程及青霉素发酵工艺。 教学重点、难点：抗生素生产工艺过程、青霉素发酵工艺流程、青霉素发酵工艺条件、青霉素的提取和精制。
一、抗生素概述
抗生素是生物(包括微生物、动物、植物）在其生命活动过程中产生的或用其他方法获得的，并能在低微浓度下有选择性地抑制或影响他种生物生命活动的化学物质。
抗生素的分类
按生物来源、作用对象、作用机制、化学结构、生物合成途径等进行分类。
1、生物来源分类
放线菌：最多，占60%，链霉素、四环素类。 真菌：青霉素、头孢菌素
细菌：大部分是多肽类（如多粘菌素） 植物及动物：蒜素、番茄素、鱼素等。
2、根据抗生素作用对象分类
抗革兰氏阳性细菌：如青霉素G、利福霉素SV等； 抗革兰氏阴性细菌：如利福平、多粘菌素等； 广谱抗生素（两者都抗）：如链霉素、金霉素、氯霉素等； 抗真菌：制霉菌素、两性霉素B、新霉素等； 抑制病毒和噬菌体：艾霉素、衣霉素等； 抗肿瘤：博来霉素、阿霉素、放线菌素D等； 驱（杀）虫剂：浏阳霉素、嘌呤霉素等。
3、按作用机制分类
抑制细胞壁合成：青霉素、头孢菌素等； 抑制细胞膜功效：两性霉素B、多粘菌素等； 抑制和干扰蛋白质合成：四环素类、氯霉素等； 抑制细胞核酸合成：丝裂霉素、利福霉素等
抑制生物能作用：有抑制电子转移的抗霉素A，抑制氧化磷酸化作用的短杆菌肽等。
二、抗生素生产工艺过程
现代抗生素工业生产过程如下：
菌种 孢子制备 种子制备 发酵 发酵液预处理 提取及精制 成品包装
1、菌种
它来源于自然界土壤等，获得能产生抗生素的微生物，经过分离、选育、纯化和鉴定后即称为菌种，并保藏起来。
当前新的动向是基因工程菌的应用。
2、孢子制备
将保藏的处于休眠状态的孢子，通过严格的无菌手续，将其接种到已灭菌过的固体斜面培养基上，在一定温
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度下培养5～7d或7d以上 。 这样培养出来的孢子数量还是有限的，为了获得更多数量的孢子以供生产需要，必要时可进一步用扁瓶在固体培养基（如小米、大米、玉米粒或麸皮）上扩大培养。
3、种子制备
其目的是使孢子发芽、繁殖以获得足够数量的菌丝，并接种到发酵罐中。种子制备可用摇瓶培养后再接入种
子罐进行逐级扩大培养，或直接将孢子接入种子罐后逐级扩大培养。
4、发酵
发酵过程的目的是使微生物大量分泌抗生素。接种量一般为10%～15%，在整个发酵过程中，需不断通入无菌空气和搅拌，以维持一定溶氧。
此外还要加入消泡剂以控制泡沫，必要时还加入酸、碱以调节发酵液的pH值，对有些抗生素在发酵过程中
还需加入葡萄糖、铵盐或前体，以促进抗生素的产生。
5、发酵液的过滤和预处理
其目的不仅在于分离菌丝，还需将一些杂质除去，如一些高价无机离子（Ca、Mg、Fe）和蛋白质等。
2+
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6、抗生素的提取
（1）溶媒萃取法
这是利用某些抗生素在不同pH条件下以不同的化学状态（游离酸、碱或盐）存在时，在水及与水互不相溶的溶媒中其溶解度不同的特性，使抗生素从水相（即发酵液）中转移到另一种液相（如有机溶剂）中，从而达到提纯的目的。目前一些重要抗生素如青霉素、红霉素、林可霉素等均采用此法。 （2）离子交换法 （3）直接沉淀法
7、抗生素的精制
这是抗生素生产的最后工序。
（1）脱色和去热原
这是精制注射用抗生素不可缺少的一步，它关系到成品的色级及热原试验等质量指标。
生产中常用活性炭脱色去除热原，也可用脱色树脂（如酚醛树脂）去除色素，对某些产品可用超微过滤法去除热原。
（2）结晶和重结晶
抗生素精制常用此法来制得高纯度成品。常用的结晶方法如下：
①改变温度结晶；②利用等电点结晶；③加成盐剂结晶；④加入不同溶剂结晶。
重结晶是进一步结晶以获得高纯度抗生素的有效方法。
（３）其他精制方法
共沸蒸馏法、柱层析法、盐析法、分子筛法等。
三、青霉素发酵工艺
菌种：最早是从点青霉中发现青霉素的，表面培养每毫升仅几个单位；后来采用常用适合深层培养的产黄青霉，但起初也只有100 u/ml。经自然选育、诱变育种、杂交育种等，新的高产菌株不断出现，当前青霉素生产单位可高达6万～7万u/ml 。
有形成绿色孢子和黄色孢子的两种产黄青霉，而按其菌丝形态，又有球状菌和丝状菌两种。下面以常用的绿色丝状菌为代表进行阐述。
1、发酵工艺流程
孢子培养 砂土孢子(或冷冻管) 斜面母瓶 25℃，6～7d 25℃
大米孢子 一级种子罐 二级种子罐
6～7d
发酵罐 放罐 提炼
◆一级种子罐培养：孢子萌发，形成菌丝， 26~28℃，通气 比1:2~3VVM，40～45h，300~350r/min，pH6.8~7.2 ◆二级种子罐培养：菌丝体大量繁殖，10%接种量，24~26℃，1:1~1.5VVM，10~14h，250~280r/min
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2、培养基
碳源：青霉菌能利用多种碳源，如乳糖、蔗糖、葡萄糖等。目前普遍采用淀粉经酶水解的葡萄糖糖化液进行流加。
氮源：可选用玉米浆、花生饼粉、精制棉籽饼粉或麸皮粉，并补加无机氮源。
前体：苯乙酸或苯已酰胺，但一次加入量不能大于0.1%，并采用多次加入方式。
无机盐：包括硫、磷、钙、镁、钾等。铁离子对青霉菌有毒害作用，应严格控制发酵液中铁含量在30μg/mL以下。
3、发酵工艺要求
●接种量：12~15%
●通气量：通气比一般为1：0.8～1.2VVM
●搅拌转速： 150～200r/min，在发酵各阶段应根据需要而调整。
●温度：采用分阶段变温培养，青霉菌生长期最适温度高于分泌期，26 ℃ 24℃ 23 ℃， 产量比25℃恒温培养高些。
● pH：前期60h内维持pH6.8～7.2，中后期维持在pH6.5左右，如高于7.0或低于6.0则代谢异常，青霉素产量显著下降。
●泡沫控制：可以用豆油、玉米油等天然油脂或化学消泡剂“泡敌”。 ●补料控制：
A、补糖：一般残糖降至0.6%左右，pH上升后开始补加；
B、补氮：硫酸铵、氨和尿素等，补氮标准是控制发酵液氨基氮含量在0.01%~0.05%；
C、补前体：间歇或连续添加低浓度前体物质，苯乙酸前体浓度控制在0.1%，苯乙酰胺控制在0.05%~0.08%为宜。
D、补少量可溶性高分子化合物：40mg/L聚乙烯醇、聚丙烯酸钠、聚二乙胺或聚乙烯吡咯烷酮（PVP），防止菌丝打断，菌丝结团，提高产量38% 。
●发酵终点判断：在线控制，准确判断放罐时间，合理确定发酵周期，一般为６～８d。菌丝自溶前必须放罐。自溶前迹象：氨基氮开始下降，pH值上升，菌丝碎片增多，发酵液黏度增加等。
４、发酵液预处理
●鼓式真空过滤器一次过滤，滤液略发浑，棕黄色或棕绿色，蛋白质含量50~200mg/100g，pH6.2~7.2。 ●去蛋白：硫酸调pH4.5~5.0+0.07%(W/V)溴代十五烷吡啶（絮凝剂）。 ●板框二次过滤：加硅藻土（0.7%W/V）助滤剂。发酵液和滤液应冷至于10℃以下（收率90%左右）。
5、青霉素的提取和精制
●溶媒萃取：青霉素在酸性时为游离酸，易溶于有机溶剂；在中性时以盐状态存在，易溶于水。利用青霉素的这一性质，先将其在pH2.0～2.5时从滤液转入醋酸丁酯（ＢＡ）中，得一次ＢＡ提取液，然后于pH6.8 ～7.1反萃取至缓冲液中；再于pH2.0～2.5 第二次转入BA中，得二次ＢＡ提取液液。
●脱色：在二次ＢＡ提取液液中加活性碳150~300g/10亿单位脱色，过滤除去活性炭 。
●共沸蒸馏或直接结晶： 鉴于以丁醇共沸结晶法所得产品质量优良，国际上较普遍采用此法生产注射品。
第七章 啤酒发酵生产工艺
教学目的：了解啤酒工业发展简史和啤酒的分类；掌握啤酒生产菌种和主要原料、啤酒发酵关键技术。 教学重点、难点：啤酒生产主要原料、麦芽汁的制造和啤酒发酵。
一、啤酒工业发展简史
啤酒历史悠久，大约起源于9000年前的中东和古埃及地区，后跨越地中海，传入欧洲，19世纪末，随着欧洲强国向东方侵略，传入亚洲。
中国近代啤酒是从欧洲传入的
1900年俄罗斯技师在哈尔滨建立了第一家啤酒作坊（乌卢布列夫斯基啤酒厂）。
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1903年在青岛由德国酿造师建立的英德啤酒厂是第一家现代化啤酒厂（青岛啤酒厂前身）。
二、啤酒的分类
根据啤酒色泽分类
淡色啤酒 色度在5~14EBC，色泽淡黄，金黄至棕黄色。 浓色啤酒 色度在15~40EBC，色泽呈红棕色或红褐色。
黑色啤酒 色度在40EBC以上，色泽呈深红褐色乃至黑褐色。
按生产方法分类
鲜啤酒(生啤酒) 啤酒包装后，不经巴氏灭菌，在较低温度下可存放1周以上，适于近地销售。 熟啤酒(杀菌啤酒) 啤酒包装后，经过巴氏灭菌，可以存放较长一段时间(60~120天)。多用瓶装或罐装。 纯生啤酒 经膜过滤除菌的包装啤酒，滤除了酵母菌和杂菌，保质期可达180天 。
按原麦汁浓度分类
低浓度啤酒 原麦汁浓度2.5～8 0P、 乙醇0.8～2.2%
中浓度啤酒 9～120P、2.5%～3.5% 高浓度啤酒 13～220P、3.6%～5.5%
三、 啤酒生产菌种及主要原料 1、啤酒生产菌种 根据酵母在啤酒发酵液中的物理性质，通常将啤 酒酵母分为上面酵母和下面酵母。 上面酵母也称顶面酵母。发酵时，酵母随CO2漂浮在液面上，发酵终了，形成酵母泡盖，经长时间放置，酵母也很少沉淀。 下面酵母也称底面酵母或贮藏酵母。发酵时酵母悬浮在发酵液内，发酵终了，酵母很快凝结而沉积在器底，形成紧密的沉淀。 2、啤酒生产用原料 主要有大麦、辅助原料、酒花和水。 （1）大麦 料，取其淀粉和蛋白质成分。酿造啤酒优质大麦的特征应为：子粒饱满，皮薄，色浅，发芽率高，无病虫害和霉变的大麦。14（2）辅助原料
谷类辅助原料一般有大米、玉米、小麦，一般使用量在10%～50%之间，常用的比例为20%~30%。 糖类辅助原料有：蔗糖、葡萄糖、糖浆等，添加量一般为10%~20%。 （3）酒花 第 30 页
长江大学生科院生物技术系 《发酵工程》讲义 属多年生草本植物，可生存20-30年，酒花为雌雄异株。选择酒花应以色泽黄绿、有清香味为好。酒花能赋予啤酒柔和优美的芳香和爽口的微苦味，能加速麦汁中高分子蛋白质的絮凝，能提高啤酒泡沫起泡性和持泡性，也能增加麦汁和啤酒的生物稳定性。16（4）水 酿造啤酒所用水包括糖化，制麦，洗涤，冷却以及锅炉用水等。以糖化用水最重要。用水部门1 酿造用水2 酵母洗涤用水3稀释啤酒用水4 啤酒过滤机操作用水5 大麦浸渍用水6 冷凝冷却用水严格达到无菌要求对水质要求符合饮用水标准消毒灭菌方法过滤（用水量少时采用）紫外线杀菌臭氧杀菌无藻类，基本符合饮用加氯或高锰酸钾杀菌水标准无藻类四、 啤酒发酵关键技术 糖化酵母啤酒酿造工艺流程：辅料→粉碎→糊化酒花并醪↓↓麦芽→粉粹→糖化→过滤→煮沸→回旋沉淀→麦汁冷却→2008年2月19日星期二长江大学生科院生物技术系充氧→接种发酵→啤酒过滤→包装→成品啤酒19（一）麦芽的制备 原大麦→预处理（清选、分级）→浸麦→发芽 →干燥→除根和贮藏→成品麦芽 1、大麦的清选和分级 2、大麦的浸渍 3、大麦的发芽 4、绿麦芽的干燥 5、除根和贮藏 （二）麦芽汁的制造 第 31 页 长江大学生科院生物技术系 《发酵工程》讲义 （二）麦芽汁的制造长江大学生科院生物技术系1、麦芽与谷物辅料的粉碎 粉碎的目的：是为了使整粒谷物经过粉碎后，有 较大的比表面积，使物料中贮藏物质增加和水、酶的 接触面积，加速酶促反应及物料的溶解。 粉碎的要求： ★麦芽皮壳应破而不碎。 ★辅助原料(如大米)粉碎得越细越好，以增加浸出物的收得率。 2、糖化 糖化是指通过麦芽中各种水解酶类作用，以及 水和热力作用，将麦芽和辅料中各种不溶性高分子 物质（淀粉、蛋白质、半纤维素等）分解成可溶性 的低分子物质(如糖类、糊精、氨基酸、肽类等) ， 此过程称糖化。由此制备的溶液称为麦芽汁。 糖化工艺技术条件 糖化温度：浸渍阶段（35~40℃）→蛋白质分解阶段（45~55 ℃ ）→ 糖化阶段（62~70℃ ）→ 糊精化阶段（75~78 ℃ ） 料水比：淡色啤酒1：4～5；浓色啤酒1：3～4；黑啤酒的料液比为l：2～3。 pH：5.6左右，可加石膏、酸或1%~5%乳酸麦芽。 糖化时间：随不同的糖化方法而异。 一次煮出糖化法煮出糖化法二次煮出糖化法三次煮出糖化法糖化方法浸出糖化法双醪糖化法升温浸出糖化法降温浸出糖化法双醪一次煮出糖化法双醪二次煮出糖化法双醪浸出糖化法国内大多数厂用此法糖化谷皮分离糖化法其他外加酶制剂糖化法34煮出糖化法 麦芽醪利用酶的生化作用和热力的物理作用，使其有效成分分解和溶解，通过部分麦芽醪的煮沸，然后与未煮沸的醪液混合，使醪液逐步梯级升温至糖化终了。根据煮沸次数，分为一次、二次、三次煮出法。 浸出糖化法 浸出糖化法是纯粹利用酶的作用进行糖化的方法。其特点是将全部醪液从一定温度开始，分阶段升温一直到第 32 页 长江大学生科院生物技术系 《发酵工程》讲义
糖化终了温度。浸出糖化法的醪液没有煮沸阶段。浸出糖化法需要使用溶解良好的麦芽 。 双醪糖化法
辅料、麦芽分别投入糊化锅、糖化锅内，辅料在糊化锅内糊化，煮沸后兑入糖化锅，逐次达到所需要的糖化温度。
3、麦汁过滤和洗糟
麦芽醪的过滤包括如下三个过程：
(1) 残留在糖化醪仅剩的耐热性的α-淀粉酶，将少量的高分子糊精进一步液化，使之全部转变成无色糊精和糖类，提高原料浸出物收得率。
(2)从麦芽醪中分离出“头号麦汁”，即第一麦汁。
(3)用热水（76～78℃）洗涤麦糟，洗出吸附于麦糟的可溶性浸出物，得到“二滤、三滤麦汁”。 4、麦汁的煮沸和酒花的添加 煮沸的目的
（1）蒸发水分、浓缩麦汁 （2）钝化全部酶和麦汁杀菌 （3）蛋白质变性和凝絮
(4) 酒花有效成分的浸出
(5) 排除麦汁中特异的异杂臭气
酒花的添加
传统啤酒酿造中多采用整朵酒花或颗粒酒花，分次添加在煮沸麦汁中，目的是为了萃取不同量的酒花组分。近代，麦汁煮沸均采用密闭煮沸，酒花的添加采用酒花添加器，把颗粒酒花预先加在添加器中，煮沸麦汁用小泵送入添加器，将酒花和麦汁混合后，送至煮沸锅。
5、麦汁冷却 麦汁冷却的目的 （1）使麦汁冷却至酵母发酵要求的温度。如下面发酵麦汁冷却温度为7~9℃，上面发酵麦汁要求冷却至10~20℃。 （2）析出和分离麦汁中的热凝固物和冷凝固物
（3）在冷却过程中使麦汁溶解一定量的氧供酵母繁殖用。麦汁中如果溶解氧不足，常出现发酵后期降糖慢的困难。
冷却方法
有两段冷却和一段冷却两种方法：
（1）过去常用采用两段冷却法： 前段冷却用冷水，将麦汁冷却到40～50℃；后段冷却用－4～－8℃稀酒精溶液作冷却介质，将麦汁冷却到发酵工艺所需要的温度。
（2）目前我国啤酒行业多采用一段冷却法： 从回旋沉淀槽出来的90～95℃热麦汁，通过板式冷却器直接冷却到工艺要求的温度7～9℃。而作为冷却介质的是2℃的冰水，通过热交换后直接升温到80℃左右。 麦汁充氧
麦汁在高温时含氧量较低，为了增加麦汁中的溶解氧，有利于酵母发酵，在麦汁冷却时降低温度，补充氧气是十分必要的，为了解决这个问题，在板式换热器后，在流动的麦汁输送管中通入除菌过滤的压缩空气或氧气，使麦汁形成细致的泡沫，达到麦汁溶氧的目的。溶解氧浓度应达6~10mg/L 。
（三）啤酒发酵
啤酒发酵分为前发酵（也称主发酵）和后发酵（也称贮酒）两个阶段。麦汁经啤酒酵母菌的主发酵以后成为尚未成熟的嫩啤酒，接着再经一段时间的低温贮藏陈酿令其后熟，即可经过滤后罐装出厂。啤酒发酵是啤酒酿造过程中的重要环节之一。
1、主发酵
低泡期、高泡期和落泡期三个阶段。
（1）低泡期
接种后15～20h，池的四周出现白沫，并向池中间扩展，直至全液面，这是发酵的开始。
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糖度下降，温度上升，产生CO2，酵母浮游于发酵液中。当麦汁倒入主发酵池后，泡沫逐渐增厚，洁白细密，并从四周向中心形成卷边状，类似菜花。
维持2.5~3天，即进入高泡期。这个阶段糖度平均每天下降0.3～0.5°P 。
（2）高泡期
发酵的旺盛期，泡沫层可厚达20～30cm，温度最高达10～12℃，此时要注意做好冷却降温工作。在此阶段，悬浮酵母达最高值，糖度平均每天降低1～1.5 °P。此阶段可维持2～3天。 （3）落泡期
发酵的衰落期，温度开始下降，降糖速度变慢，平均每天降糖0.5～0.8°P，泡沫开始收缩，形成褐色泡盖（由于蛋白质、树脂、酵母菌和其他杂质组成的浮游体），酵母菌逐渐下沉。此时需要进行人工降温。当11%原麦汁的发酵液糖度降低至3.5～4.0°P，12°P原麦汁的发酵液糖度降至4.0～4.5°P时，既可下酒进入后发酵。此阶段维持2~3天。
2、后发酵
麦汁经主发酵后的发酵液称为嫩啤酒，也称新啤酒。此时酒的CO2含量不足，口味不成熟；大量的悬浮酵母和凝固析出的物质尚未沉淀下来，酒液不够澄清，因此还需在0～2℃的密闭罐中经1～3个月的后发酵，使嫩啤酒达到澄清和成熟。啤酒的后发酵也称贮酒，是啤酒发酵的第二阶段。 后发酵的作用 ①使残糖继续发酵 ②使酒液饱和CO2 ③促进酒液成熟 ④促进酒液澄清
⑤促进蛋白质-多酚复合物的析出 ⑥降低氧含量，使酒液处于还原状态
（四）成品啤酒
1、啤酒的过滤
对啤酒过滤或分离处理的要求是：产量大，质 量高，酒与CO2的损失少，不吸氧，不污染，不影响 酒的风味。 过滤原理：
啤酒过滤是利用过滤介质，将啤酒悬浮的微小颗粒，自酒液内分离出去，而得到清澈透明无悬浮物啤酒的过程。
啤酒过滤或分离的方法有：滤棉法； 硅藻土过滤法 ； 板式过滤法； 微孔薄膜过滤法 ；离心分离法。 过滤的组合形式：
? 常规式：硅藻土过滤机＋精滤机（板式过滤机）
? 复合式：离心澄清机＋硅藻土过滤机＋精滤机
? 无菌过滤式：离心澄清机＋硅藻土过滤机＋袋式过滤机＋精滤机＋微孔薄膜过滤机 2、杀菌
? 多采用巴氏杀菌
第八章 氨基酸生产工艺
教学目的：了解发酵法生产氨基酸的历史、现状及发展趋势，了解氨基酸发酵的代谢控制；掌握氨基酸发酵的工艺控制、谷氨酸发酵生产工艺和赖氨酸发酵生产工艺。
教学重点、难点：温度、pH、溶氧对氨基酸发酵的影响及控制；谷氨酸发酵：淀粉水解糖的制备和发酵工艺控制；赖氨酸发酵生产工艺控制。
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氨基酸可以采用化学合成、从天然物质中提取（蛋白质水解）、微生物发酵及酶催化等方法生产。
一、发酵法生产氨基酸的历史、现状及发展趋势
1、发酵法生产氨基酸的历史
氨基酸的制造：1820年水解蛋白质；1850年化学合成 。
1957年日本科学家Kinoshita等人发现，在培养某些微生物，如谷氨酸棒杆菌会产生谷氨酸的积累，从此揭开了用微生物发酵方法生产氨基酸的历史新篇章。谷氨酸是第一个，也是目前产量最高的氨基酸。
国内1958年开始筛选谷氨酸产生菌并进行发酵基础研究，1964年上海天橱味精厂投产。全世界的年产量超过50万吨，中国已经成为世界上最大的谷氨酸生产和消费国。
赖氨酸是人和动物的必需氨基酸之一，在食物和动物饲料中添加适量的赖氨酸有利于人类健康和动物的生长。目前，赖氨酸生产菌的发酵水平已经达到100g/L以上，微生物发酵法成了赖氨酸工业化生产的惟一方法。 2、氨基酸生产现状
生产氨基酸的大国为日本和德国。日本的味之素、协和发酵及德国的Degussa(德固沙)是世界氨基酸生产的三巨头。它们能生产高品质的氨基酸，可直接用于输液制剂的生产。
据统计，我国目前有氨基酸生产企业100余家，主要是天津氨基酸公司，湖北八峰氨基酸公司，但目前无论生产规模及产品质量还难于与国外抗衡。 3、发酵法生产氨基酸的发展趋势
获得高产菌种始终是发酵法生产氨基酸的关键。利用基因重组技术获得氨基酸高产菌种已经成为新的发展方向。
发酵法生产氨基酸的另一个发展方向是采用先进的发酵技术。
从发酵液中分离提取氨基酸的新技术和新工艺对于提高氨基酸发酵工业的水平和经济效益也有十分重要的作用。
二、谷氨酸发酵生产工艺
(一)淀粉水解糖的制备
国内味精厂多采用酸水解法，其水解工艺流程如下：
原料 调浆（液化） 糖化 冷却 中和 脱色 过滤 糖液 1、调浆：干淀粉用水调成10-110Bé（波美度）的淀粉乳，加盐酸0.5-0.8％至pH1.5。（波美度是用波美密度计测
出的密度） 2、糖化：在糖化锅内进行，蒸汽加热，加压糖化约25min。冷却至80℃以下中和。 3、中和：烧碱中和，至pH4.0-5.0
4、脱色：活性炭吸附法和脱色树脂法。活性炭用量为淀粉原料的0.6-0.8％，在70℃及酸性条件下搅拌后过滤。
国外味精厂一般采用酶水解法。 双酶法糖化：以大米或碎米为原料时采用。
大米进行浸泡磨浆，再调成15 0Bé，调pH6.0，加a-淀粉酶进行液化（85 ℃、30min）转化为糊精及低聚糖，然后加糖化酶将糊精或低聚糖进一步水解，转变为葡萄糖(60 ℃糖化24h)，过滤后可供配制培养基。 酶水解法的水解液中色素等杂质明显减少，并简化了脱色工艺。现在，国内也逐渐采用这一方法。
(二)菌种扩大培养
斜面培养 一级种子培养（摇瓶） 二级种子培养 发酵
1、斜面培养 ●我国各工厂目前使用的菌株主要是钝齿棒杆菌、北京棒杆菌、天津短杆菌及它们的各种诱变株。 ● 斜面培养基：蛋白胨 1%，牛肉膏1%，氯化钠 0.5%，琼脂 2%， pH 7.0-7.2。 ● 培养条件：32℃培养18-24h。
2、一级种子培养
由葡萄糖、玉米浆、尿素、磷酸氢二钾、硫酸镁、硫酸铁及硫酸锰组成。1000ml装200-250ml振荡培养，32℃ 培养12h。
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3、二级种子培养 用种子罐培养，料液量为发酵罐投料体积的1％，培养基组成与一级种子相似，用水解糖代替葡萄糖，于32℃ 进行通气搅拌7-10h。
种子质量要求：二级种子培养结束时，无杂菌或噬菌体污染，菌体大小均一，呈单个或八字排列。活菌数为10～10 /ml。
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(三)发酵工艺条件与控制
◆温度：发酵前期（0~12h）30~32℃，中后期（12h以后，产酸期）34~37 ℃ ；
◆ pH：前期（0~12h） pH7.5~8.0，中后期pH7.0~7.4。通过采用流加尿素，氨水或液氨等办法调节pH，补充
氮源。 ◆通风与搅拌：在发酵前期长菌体阶段以低通风量为宜，通风量过大，生物素缺乏，抑制菌体生长。在发酵产酸阶段，需要大量通风供氧，以防过量生成乳酸和琥珀酸，谷氨酸减产；但过大通风，则大量积累α-酮戊二酸，谷氨酸减产。 ◆泡沫控制 A、机械消泡 B、化学消泡剂：花生油、豆油、菜油、玉米油、棉子油和泡敌。用量：天然油脂类一般为发酵液的0.1%~0.2%(V/V),泡敌为0.02%~0.03%(V/V)。 ◆接种量：一般1%~2%左右(应用于低中糖发酵)或5%~10%（添加青霉素高生物素发酵）。 ◆生物素量控制：一般为亚适量（若过量则发酵过程菌体大量繁殖，不产或少产谷氨酸），或采取添加青霉素高生物素发酵。 ◆发酵时间：一般30~32h。 ◆谷氨酸产生菌的发酵条件与产物的关系 控制因子氧气NH4+pH 磷酸生物素发酵产品转换乳酸或琥珀酸（通气不足）←→谷氨酸（通气充足）α-酮戊二酸（缺乏）←→谷氨酸（适量）←→谷氨酰胺（过量）N-乙酰谷氨酰胺（酸性）←→谷氨酸（中性或微碱性）缬氨酸（高浓度）←→谷氨酸乳酸或琥珀酸（丰富）←→谷氨酸（亚适量） (四)谷氨酸提取工艺 1、等电点法：谷氨酸等电点为pH3.22，用HCl调。此法操作方便、设备简单，一次收率达60％左右；但周期长，占地面积大。 2、离子交换法：当发酵液的pH低于3.22时，谷氨酸 以阳离子状态存在，因此可用阳离子树脂进行交换。 此法过程简单、周期短，设备省占地少，提取总收率可达80％～ 90％；缺点是酸碱用量大废液污染环境。
（五）谷氨酸制造味精的工艺流程 粗谷氨酸 →Na2CO3溶液中和 →除铁、脱色 →浓缩结晶 →离心分离 →结晶味精 →干燥 →分级过筛 →各级味精包装。 三、赖氨酸发酵生产工艺 1、赖氨酸的生物合成途径 第 36 页
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2、赖氨酸生产工艺
（1）培养基的配制
碳源：赖氨酸产生菌均不能利用淀粉，只能利用葡萄糖、果糖、麦芽糖和蔗糖，作为这些糖类的来源原料主要是淀粉（如大米、玉米和薯类）和糖蜜（甘蔗、甜菜）。采用双酶法水解。 氮源：无机氮源常用的有（NH4）2SO4、尿素和液氨；有机氮源常用的有大豆饼粉、花生饼粉和毛发的水解液。但赖氨酸产生菌缺乏蛋白质分解酶，不能直接分解蛋白质，须将有机氮源水解后才能被利用。
生长因子：赖氨酸产生菌几乎是谷氨酸产生菌的各种生化标记突变株，均为生物素缺陷型，需要生物素作为生长因子，同时也是某些营养缺陷型，如高丝氨酸、丙氨酸、亮氨酸等，这些物质也是生长因子。 （2）种子制备与扩大培养
A、国内主要的赖氨酸生产菌
目前国内所使用的赖氨酸生产菌主要有：
①中国科学院微生物研究所的北京棒杆菌AS1.563和钝齿棒杆菌PI-3-2； ②上海工业微生物研究所选育的黄色短杆菌AⅢ； ③黑龙江轻工业研究所的241134； ④广西轻工业研究所的No.G12-6等。
B、种子制备与扩大培养
斜面 → 一级种子(摇瓶) → 二级种子(种子罐) → 发酵罐
（3）发酵生产的工艺条件与控制 ●温度：前期32℃，中后期34 ℃
●pH：控制6.5～7.5，最适6.5 ～7.0 ，在整个发酵过程中平稳为好。
●风量：1:0.35～0.45(v/v)；罐压0.1MPa
●采用二级种子扩培：接种量约为2%，种龄8～12h；
种子扩大阶段 斜面种子 一级 种子 二级 30～32℃、10～12h 200／1000mL、100 ～120r/min、30～32℃、 15～16h 30～32℃、 200r/min 、通风量1：0.2基本培养条件 三级种子扩培：接种量约10%，种龄为6~8h。 种子 （v/v.min)、8～11h ●生物素：一般添加过量生物素有利于赖氨酸发酵，一般在20～30μg/L
●补糖：可采用流加工艺，糖浓度降为5%左右时开始补糖，将糖浓度提高2%～3%，补3～5次，最终体积在罐容积的70%。
●发酵时间：60~70h。 （4）赖氨酸提取和精制
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