制备凝胶板前先用无水乙醇擦拭玻璃板内面。用2.5%琼脂封边，并用蒸馏水检验是否密封完好。密封好后用吸管缓慢加入分离胶，离顶端约1.5 cm时注入蒸馏水。待界面清晰后，吸去蒸馏水，用吸管吸取配好的浓缩胶冲洗凝固的分离胶面，插入样品槽模板，用吸管缓慢注入浓缩胶。待凝固好后，在玻璃板上用记号笔划出点样槽底线，轻轻拔出样品槽模板。 3.4 样品制备

称取脱盐或冻干的蛋白0.01g，加1mL蒸馏水溶解后，10000rpm离心5min，吸取上清50μL加等体积的样品缓冲液，沸水浴加热3min，取出瞬间离心，上清液备用。

3.5 标准蛋白制备

方法同样品制备，本实验的标准蛋白已经制备好，解冻后直接加样即可。 3.6 加样

用加样器分别取已高速离心过的样品液的上清液5、10、15μL，依次加到三个样品槽的底部。用加样器分别取标准蛋白质10、20μL，依次加到三个样品槽的底部，标准蛋白泳道的两侧各加10μL样品缓冲液作空白对照。并作好记录以免混淆。上好样后缓慢往样品槽中加入电极缓冲液，注意不要有气泡。 3.7 电泳

连接电泳仪的直流电源，正极连在凝胶板的下端，负极连在凝胶板的上端，即有样品的一端。电流值恒为10mA。大约经过4~5 h，样品缓冲液中的溴酚蓝指示剂到达离凝胶底部0.5 cm处，关闭电源，取下电泳板，并将两片玻璃板分开，将凝胶板小心移入染色槽中。 3.8 染色、脱色

加染色剂染色过夜。倾去染色液，加脱色剂将背景的蓝色脱尽，中间要更换数次脱色固定液，然后将凝胶板制成干板、扫描。 3.9 测量相对泳动率Rm值，计算分子量

测量溴酚蓝的泳动距离，将它作为相对泳动率的标准1.0。测量标准分子量蛋白质的泳动距离，算出它们的Rm值（Rm=样品迁移距离／染料迁移距离）。

以分子量的对数值为横坐标，Rm值为纵坐标，将标准分子量蛋白质的坐标点连为一条直线，即得标准曲线。

算出样品蛋白质的Rm值，从标准曲线上查出其分子量的对数值，换算出分子量。

4 实验结果 作出标准曲线及换算样品蛋白质分子量

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图1 SDS-PAGE测定蛋白质分子量的电泳图谱

图1中，标准蛋白产生的6条条带分别标记为a、b、c、d、e、f，卵清蛋白产生的两条

C

条带分别标记为A、B；人血清蛋白产生的三条带分别标记为C、D、E。5、10分别指样品蛋白质加样量；

在图中测量出下列值：溴酚蓝的泳动距离

D

D= 9.7;

标准蛋白的泳动距离：Da =1.0；Db =1.5；Dc =2.6；Dd =3.7；De =5.1；Df =6.2。 标准蛋白的相对泳动率：Ra =0.103 ；Rb =0.155；Rc =0.268 ；Rd =0.381；Re =0.526 ；Rf =0.639。

卵清蛋白的泳动距离：DA =1.7；DB =3.4；人血清蛋白的泳动距离：DC =1.9；DD =4.2；DE =4.9。

E

样品蛋白质的相对泳动率：RA=0.175；RB =0.351 ；RC =0.196 ；RD =0.433；RE=0.505 。 (Rm=Dm/D)

表1 标准蛋白的lgMW与Rm值

Rm lgMW

a 0.639 4.15

b 0.526 4.30

c 0.381 4.49

d 0.268 4.63

e 0.155 4.82

f 0.103 4.99

各条带对应的标准蛋白分子量的对数值与相对迁移率见表1。根据表1，以标准分子量的对数值（lgMW）为横坐标，相对迁移率（Rm）为纵坐标，将标准蛋白质的坐标点连为一条直线，即得标准曲线（图2），并根据此曲线得趋势线公式：y= -0.1116x + 0.7359，由该公式计算出样品蛋白质中各个条带相对应的蛋白质样品分子量对数值，换算出分子量（表2）。

5 讨论

1.卵清蛋白中分离出2种蛋白质，分子量分别为106169.6和2811.9；人血清蛋白中分离出三种蛋白质，分子量分别为68865.2、517.6和116.9。

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图２　用低分子量标准蛋白所做的标准曲线0.70.60.50.40.30.20.1001y = -0.1116x + 0.7359234567表2 样品蛋白质的Rm值、lgMW和分子量（MW）

Rm lgMW MW

卵清蛋白 A 0.175 5.026 106169.6

B 0.351 3.449 2811.9

C 0.196 4.838 68865.2

人血清蛋白

D 0.433 2.714 517.6

E 0.505 2.068 116.9

2. 电泳条带的粗细能定性的反映样品中蛋白质含量的相对多少，所以在本实验中，卵清蛋白所得的2条带中，，B条带是我们所提取的卵清蛋白的条带；人血清蛋白所得的3条条带中，C条带是我们所提取的人血清蛋白的条带。

3.实验所得蛋白质分子量与实际分子量相差较大，即测量值与真实值相差较大，原因可能如下：1）实验过程中测量的不准确；2）分子量的测定不能完全依赖SDS-PAGE，因为一些蛋白质的迁移是不规则的；3) 要做到非常严谨的测定蛋白质分子量，至少应在两个不同的丙烯酰胺凝胶浓度下进行电泳；4）从图1上看，样品蛋白质的两种加样量的泳道上都产生了很粗的条带，这可能是由于样品浓度太大，给迁移位置的测量造成了困难，这也是造成结果误差的一个原因；5）干胶后引起蛋白质带变宽，尤其是厚胶难以准确对蛋白质和指示剂前沿定位。

3. 每空的上样量不能过大，以免样品溢出，造成各泳道相互污染。 4. 为了避免边缘效应，在未加样的泳道加入等量的样品缓冲液。

5. 加样的过程中，个别样品不能沉到加样孔底部。其原因可能是：样品缓冲液中没

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有足够的甘油，或梳子安放的不合适，使孔底留有聚合的丙烯酰胺，本实验中后面一个原因的存在的可能性更大一些。

6. 样品蛋白质条带出现拖尾现象。这是因为在浓缩胶中蛋白质浓度过高而产生沉淀所致。一般认为聚合的蛋白质在电泳过程中会逐渐溶解，所以电泳前充分热变性和对样品进行稀释可以得到改善。

7. 未聚合的丙烯酰胺是一种皮肤刺激物和神经毒素，操作时必须戴手套。

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