4.次日：将一抗溶液孵育的膜一起从4 ℃取出，室温平衡30 min~1 h，然后从一抗溶液中取出膜，用TBST漂洗滤膜3次，每次10min。震荡摇床上洗膜。 5.加入二抗溶液，室温摇床1~2h。

6.从二抗溶液中取出膜，用TBST漂洗滤膜3次，每次10min。 注意事项：

1. 用镊子夹膜时要夹膜的边角，防止镊子损伤膜上蛋白。 2. 将膜放入自封袋后，要将气泡赶出，使膜能充分孵育。 3. 做哪些指标要跟大家沟通，有做相同指标可错开以节省抗体。 4. 配制一抗、二抗千万不能认为抗体越多越好，易出现高背景的现象。

化学发光成像

1. 打开Gene Genius 化学发光凝胶成像系统（Syngene）。 2．Super Signal West Pico 化学发光底物的A液与B液等体积混合。

3.将膜铺于显影垫片上，避免在膜下产生气泡，将垫片立起，用滤纸将膜外液体吸干。

4.每次显影只显一条膜，将膜调整至最大视野，尽量保持各张膜的视野尺寸大小相同。成像时，可设置拍摄多张图片，曝光时间由短到长。

5.设置显影仪后，将显影液均匀滴加在膜上（每条1.5×8cm2的膜约200-250μl），待显影液与膜上二抗反应1min后，开始显影。 注意事项

1. 显影过程注意避光。

2. 铺膜后尽量使膜上残留较少液体，避免膜干掉，要迅速滴加显影液。 3. 每张膜分开显影，以便挑选曝光强度适合的图片。

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五、思考题

1. SDS在该电泳方法中的作用是什么？

2.Western blotting 中哪些步骤可以减少杂背景信号？

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