有利于生物遗传的相对稳定。在突变随机发生的前提下，间隔基因的内含子突变不会承受自然选择压力；

增加变异概率，有利于生物的进化。间隔基因长度的增加在某种程度上与增加了基因内的重组变换概率，这样可形成蛋白结构域的重新组合；

扩大生物体的遗传信息储量。通过改变读码框或利用内含子编码基因，或对内含子以不同方式剪接；

利用内含子进行代谢调节。例：酵母细胞色素b基因内含子II编码一个成熟酶，利用成熟酶切除未成熟的mRNA中的内含子。

3.什么是顺反子?用“互补”和“等位基因”说明“基因”这个概念。

4.IS元件整合到靶位点时会发生什么，IS元件整合到靶位点时会发生什么? IS元件的末端是反向重复序列，这两个重复序列高度同源，由供体提供IS元件的一个拷贝到靶位点，涉及酶切、复制、重组，即通过转座酶与末端IR和受体靶位点序列DNA双链进行特定长度的交错切割，再将IS元件连接到靶位点的凸出单链上，最后由聚合酶填补空缺完成转座。当IS元件整合到靶位点后，插入位点的宿主靶DNA序列被复制，在转座子两端产生宿主靶DNA序列的正向重复，因此IS DNA两侧的IR总是与短的正向重复相连，正向重复序列的长短受控于转座子插入时对靶位点产生错切序列的长短。

5.列出一个转座子插入到一个新位点所要求的步骤。

① 复制型转座：发生转座的整个DNA序列是原转座因子的一个拷贝，转座伴随着新拷贝的复制。

a.转座酶对供体转座子的末端反向重复序列和受体靶位点序列的DNA双链进行特定长度的交错切割；

b.共同的机制使转座子和靶序列的切口末段发生交叉共价连接，形成单链转移复合体；

c.DNA聚合酶利用连接缺口处的3’-OH末端和模板链填补缺口，完成转座子及正向重复序列的复制，最后将供体复制子与受体复制子分子连接成具有两个转座子的共联体，两个拷贝的转座子位于两个复制子的连接处，方向相同，正向重复；

d.由拆分酶催化在两个转座子拷贝之间的同源重组交换，释放出两个独立的复制子，另一个复制子则获得了被复制的转座子，并在转座子的两端形成与最初发生错切长度相同的，短的正向重复序列。

②非复制型转座：转座因子作为一个整体直接从原始位点插入转座到新的靶位点，而供体原来的位点上已没有转座因子了。有两种转座机制：

A.利用供体和受体靶DNA序列的直接连接完成转座，只需转座酶，涉及转座子从供体DNA释放和在靶位点上的插入，在供体位点会造成DNA的断裂，转座子的一条单链与靶位点的单链连接，互补链缺口经修复合成填补，完成转座后同样在转座子两侧形成靶位点序列的正向重复。

B.保守转座：转座酶在转座子两端发生剪切，产生双链断裂，完整的转座子从供体中释放出来，转座子与已切断的靶位点连接，复制、修补缺口。

6.比较基因组的大小和基因组复杂性的不同：

—个基因组有两个序列，一个是 A，另—个是 B，各将2000bP长。其中—个是由400bp的序列重复5次而成，另一个则由50bp的序列重复40次而成，问：

(1)这个基因组的大小怎样? (2)这个基因组的复杂性如何?

7.被加工的假基因与其他假基因有哪些不同?它是如何产生的？ 功能基因累积突变型假基因：某基因发生了对其表达过程中的一个阶段或全部阶段具有阻断作用的突变，就会使该基因失去活性。这些变化包括消除起始转录的信号，阻止在外显子与内含子的连接点进行剪接或过早地终止翻译等。

加工假基因：基因组中与RNA转录物相似的失活基因。已加工过的假基因有明显的RNA加工反应的印迹，这表明它们在某种程度上经过RNA阶段。形成：①DNA转录前体RNA后经剪接加工形成成熟的RNA,再反转录成cDNA，随后插入到基因中；②DNA转录的前体RNA经加工形成成熟的RNA，进而与DNA形成杂合双链插入到基因中，形成无启动子，无内含子，无终止子的加工型假基因，或反转座假基因。 假基因生物学意义：假基因以基因家族中的一个成员存在，在进化上具有进化的整体性，不承受选择压力；无论其序列是否有功能，基因簇每个成员都会发生重复、缺失和重排。通过对突变体的自然选择，使优良突变基因得以进化；部分回答了生物进化的C值矛盾。

8.请描述 C值矛盾，并举一个例说明。

某生物单倍体基因组DNA的核苷酸数为大C值，受中心法则限定，编码结构基因DNA的核苷酸数为小c值。生物进化的C值矛盾表现为：

①生物体进化程度高低与大C值不成明显相关（非线性）。例：有些哺乳动物的基因组叫两栖类的多数生物还要小；

②亲缘关系相近的生物大C值相差较大。例：昆虫类、两栖类和显花植物类C值相差几乎上百倍 ；

③一种生物内大C值与小c值相差极大。例：Euk. 人体 c = C/10； Prok. Φx174 c ＞C )。

9.跳跃复制的结果是什么?

基因的重复可以通过跳跃复制产生，复制后的拷贝发生突变和突变累积，然后 形成基因簇，最后分化成执行不同功能的基因。重复序列的突变在某种意义上又进一步抑制了不对称交换，维持了进化所选留的新基因的相对稳定。

10.列举一个已知的 DNA序列编码一种以上蛋白质的三种方法。 出现在重叠基因中：

①在核糖体结合位点之后含有多重起始位点，或终止密码的漏读（其中UGA、UAG易被漏读、错读，UAA能严格终止），例如两种蛋白质均从同一起始密码开始起译，其中一种蛋白在遇到第一个终止密码是就停止翻译，另一种蛋白由于发生漏读，核糖体继续翻译到下一个终止密码处；

②以不同的读码框架对同一条mRNA进行识读和翻译；

③选择不同的起始密码AUG，但按同一个读码框架对同一条mRNA进行识读和翻译；

④编码在同一DNA区段不同极性单链上的重叠基因，即反向重叠基因； ⑤真核生物内含子选择性剪接可由同一初级转录物产生多种蛋白质，即同源异型蛋白。

另一个版本：

①在核糖体结合位点之后含有多重起始位点 ②在一两个碱基的移码方式出现重叠的可读框 ③不同的剪接方式，产生不同的mRNA方式

第三章

二 问答题:

1.设计实验克隆大肠杆菌的复制子。

用荧光物质特异性标记大肠杆菌的复制子，利用相同的限制性内切核酸酶分别酶解E.coli DNA复制子和具有抗生素基因（例如Ampr）质粒DNA，根据荧光标记筛选出切下的的E.coli DNA复制子片段，与质粒DNA片段连接后，转化缺乏

Ampr基因的受体菌（Amps），接种于含有氨苄青霉素的培养基中，选择能正

常生长的菌落，即可克隆到E.coli 复制子的DNA片段，因为只有同时具有复制子和Ampr的基因组DNA的菌落才能既检测到荧光标记，由能在含有氨苄青霉素的培养基中正常繁殖。

2.试证明一个基因中只有一条 DNA链作为模扳被转录。 分子杂交试验：分别将体外双向转录体系和体外不对成体系（与体内相同方向的单向转录）中分离得到的转录物与体内转录物杂交，如果能检测到杂交双链产物，则可证明体内的目标片段是按双向转录模式进行转录的，反之，就是以不对称转录方式进行单向转录。

3.描述 Matthew Meselson-Franklin Stahl试验，说明这一实验加深我们对遗传理解的重要性。

①将N加入到培养E.coli的培养基内，标记合成的新生DNA单链； ②将E.coli转移到N14培养基内，经一个世代后，提取E.coli DNA Cscl密度梯度离心，测定DNA分子密度。

15 分析：如果为全保留复制，则出现两条不同密度DNA带纹； 如果为随机复制，则出现一条中等密度DNA； 如果为半保留复制，则出现一条中等密度DNA. 实验结果将全保留复制否定；

③提取在N14培养基内复制一代后的DNA（即第二世代），密度梯度离心

1的N15随机分布在4条双DNA链中，出现一4条低密度DNA；如果为半保留复制，则出现两条低密度DNA，两条中等密度DNA ④将这些DNA分子热变性，单链DNA密度梯度离心

分析：如果为随机复制，则出现一条带纹；如果为半保留复制，则出现一条高密度带纹和一条低密度带纹； ⑤让E.coli再继续复制第三代、四代，两条带纹中，低密度DNA带纹逐渐变宽，中等密度DNA始终为两条带两种放射性标记的双链DNA.

分析：如果为随机复制，则占

4.什么是质粒的相容性?什么是不相容群?机制是什么?

质粒的相容性是指两种质粒是否可以共存于同一个细胞，如果能够共存则叫相容（又叫亲和），不能共存则称为不相容。从本质上说，能够共存于同一个细胞中的质粒具有不同的复制机制，因而复制时互不干涉，并保持稳定。根据质粒的这一特性将质粒分为若干个不相容群。同一个不相容群中的质粒不能共存于同一个细胞，因而他们的复制机制相同，因此凡能共存于同一个细胞中的质粒属于不同的不相容群，因而他们的复制机制不同

不相容性质粒：具有共同的复制调控机制(相互竞争, 相互制约)；

相容性质粒( F, ColEI )：复制调控机制完全不同(和平共处, 互不干扰)。

5.解释在DNA复制过程中，后随链是怎样合成的。

双链DNA分子复制起始时RNA聚合酶从复制原点处使双链DNA分子局部开链，前导链在一段RNA引物的发动下按连续合成的模式完成合成过程：在合成10-12个核苷酸的RNA片段之后，再由DNA聚合酶完成前导链DNA的合成，在完成近1000-2000个核苷酸的DNA合成后，后随链才在引发酶的作用下开始启动冈崎片段的引物RNA的合成：引发酶往往与其他相关酶类结合在一起形成引发体合成RNA引物分子，为DNA聚合酶III合成DNA分子提供了启动聚合的3’-OH末端，冈崎片段聚合完成后，DNA聚合酶I利用其外切和聚合功能降解RNA引物分子，同时利用前一个冈崎片段DNA的3’-OH聚合DNA,完成类似切口平移的过程，填补切除引物分子后的缺口，最后由DNA连接酶将冈崎片段连接。

6.描述滚环复制过程及其特征。

过程：单链DNA经复制成为双链复制型（RF），复制的起始是在RF型DNA分子的正链（+）上形成一个切口，当有3’末端外露，5’末端游离后，以另一单环负链（-）为模板开始启动新生正链的前导链合成，游离的5’端按冈崎片段方式启动后随链的合成；随模板链（-）的滚动，新生正链不断在3’末端延伸（共价延伸方式），当其完全游离出亲本单环负链后，自身立即作为模板链按不连续方式合成冈崎片段，经过多轮的滚动，合成出的双链DNA分子是多个基因组串联在一起的多联体，后经切割才形成单体分子。

特征：①新生正链与亲本正链总是连在一起；②滚环复制的DNA图形看似“?”字母；③前导链的启动不需要引物，也不需要转录激活，直接在3’—OH端切口上启动复制，整个复制过程只有一个复制叉（单项复制）。

7.研究表明小麦成熟胚，未成熟幼胚，幼嫩花序，叶片细胞中端粒DNA的长度分别为30 kb，80kb, 45kb, 23kb。请讨论这一研究结果的分子生物学机理。（8分）

随着组织、细胞的老化，染色体端粒DNA的长度逐渐缩短。 真核生物发育终端的体细胞中端粒酶基因表达如果受到抑制，将会导致体细胞中染色体DNA一代一代的短缩，当短缩至一个重要的信号序列处，就会引起细胞的早衰或死亡。

r r

8.某一质粒载体具有 Tet和 Kan的表型，（四环素和卡那霉素）在 Kan抗性基因内有一Bgl Ⅰ的切点。现用Bgl Ⅰ切割该载体进行基因克隆，问：(1)转化后涂皿时应加什么样的抗生素?(2)培养后长出的菌落具有什么样的抗性基因型?(3)如何利用抗性变化筛选到含有插人片段的重组体? 1>转化后涂皿时应加四环素。（用Bgl Ⅰ切割该载体，破坏了Kan抗性基因。） 2>培养后长出的菌落具有Tetr Kans和Tetr Kanr的抗性基因型。

3>重新点种在含四环素和卡那霉素的平板上，然后点种在只含四环素的平板上，选择只在四环素平板上生长的菌落（能在四环素平板上生长而不能再含四环素和卡那霉素的平板上生长的菌落），即为所需的重组体（Tetr Kans）。

第四章

二、 问答题:

1 概括典型原核生物启动子的结构和功能，并解释什么是保守序列。 原核生物启动子：上游控制元件（UCE）+核心启动子=扩展的启动子

UCE:即-40～-70区,能与CAP-cAMP复合物结合，是激活转录的正调控位点。 核心启动子：①-35区：Sextama盒，是RNA聚合酶首先识别和结合的位点（R site），或松弛结合位点。保守序列TTGACA,保守序列突变影响?因子结合效率； ②-10区：Pribnow盒，是RNA聚合酶随后滑到区域的结合位点（B site）,或紧密结合位点。保守序列TATAAT,保守序列突变影响开放复合物形成的速度，富含AT，解链发生区；③+1位点：转录起始点（I site），几乎均为嘌呤（A或P）。④-35区和-10区间有17±1bp的间隔序列，其保守性有利于RNA聚合酶的启动，保证了-35区和-10区能与?因子同时作用，为RNA转录提供恒定DNA双链解链区间，17bp的间距较17bp的序列对转录更为重要，间距的突变趋近17bp时，表现为上调突变，远离17bp时，表现为下调突变。启动子序列与-35区序列为TTGACA及-10区序列为TATAAT的标准启动子序列同源性程度的大小决定了启动子的强弱。

保守序列：指DNA分子中的一个核苷酸片段或者蛋白质中的氨基酸片段，它们在进

化过程中基本保持不变。这些序列高度相似，却来自不同的物种或同一生物体产生的不同分子。从跨种保留的角度来看，这种序列的存在意味着在形成不同物种的进化过程中，有一段特殊的基因序列被保留了下来。

2.简述原核生物RNA聚合酶全酶的组成以及各个亚基的功能。

RNA聚合酶全酶：5个亚基，?、?、?、?'和?，依靠空间结构专一性与特异性地与DNA结合。 ①?亚基：结合核心酶启动转录后脱离核心酶，使核心酶促延伸。可重复使用； 使全酶识别Sextama Box（R位点）、Pribnow(B位点),选择并紧密与模板链发生特异性结合，保证了相对较高的转录效率；

修饰RNA聚合酶的构型：降低全酶与DNA的非专一性结合力，增强全酶与R, B site的专一性结合力，导致RNA链的延伸缓慢； ②?亚基：核心酶的组建因子；

促使RNApol与DNA 模板链上游转录因子结合； 位于前端的α因子使双链解链为单链； 位于尾端的α因子使单链新聚合为双链。

③?亚基：促使RNA聚合酶聚合NTP，合成RNA链，使转录延伸；

完成 NMP之间的磷酸脂键的连接； 与RNA编辑有关；

与 Rho(ρ)因子竞争RNA 3’-end；

构成全酶后，β因子含有两个位点：起始位点（I）对利福平敏感，只专一性与ATP/GTP结合，决定了RNA的第一个核苷酸为A或G,延伸位点（E），对利福平不敏感，对NTP没有专一性，保证了RNA的延伸。

'? ④亚基：强碱性亚基；

促使RNA聚合酶与非模板链结合； 受K酶抑制。

3.原核生物与真核生物的mRNA的各有什么特点?

原核生物mRNA的特点为:1>半衰期短。原核生物中，mRNA的转录和翻译是在同一个细胞空间里同步进行的，蛋白质合成往往在mRNA刚开始转录时就被引发了。2>许多以多顺反子的形式存在。原核细胞的mRNA(包括病毒)有时可以同时编码几个多肽。3>原核生物mRNA的5’端无帽子结构，3’端没有或只有较短的多聚A结构,原核生物起始密码子AUG上游有一被称为Ribosome Binding Site (RBS)或SD序列（Shine –Dalgarno sequence）的保守区，因为该序列与16S-rRNA 3’端反向互补，所以被认为在核糖体-mRNA的结合过程中起作用4>原核生物常以AUG（有时GUG，甚至UUG）作为起始密码子; 真核生物mRNA的特点为：1>真核细胞mRNA的合成和功能表达发生在不同的空间和时间范畴内。mRNA以较大分子量的前体RNA出现在核内，只有成熟的、相对分子质量明显变小并经化学修饰的mRNA才能进入细胞质，参与蛋白质的合成。2>以单顺反子形式存在 。3>真核生物mRNA的5’端存在帽子结构，除组蛋白基因外，真核生物mRNA的3’端具有多聚A结构，真核生物的mRNA中，由DNA转录生成的原始转录产物-----前体mRNA，要经过5’加“帽”和3’酶切加多聚腺苷酸，再经过RNA的剪接，编码蛋白质的外显子部分就连接成为一个连续的可译框，通过核孔进入细胞质，作为蛋白质合成的模板。真核生物的mRNA还可以通过RNA编辑在初级转录物上增加、删除或取代某些核苷酸而改变遗传信。４＞真核生物几乎永远以AUG作为起始密码子。

4.β-地中海贫血症患者不能合成β-球蛋白。将患者与正常人β-球蛋白基因的DNA序列进行比较分析发现，除第一个intron中有一个碱基发生了改变外，所有序列相同，但其mRNA分子比正常人多出约100多个核苷酸。根据这一结果，说明患者缺失β-球蛋白的原因。

第一个intron中有一个碱基发生了改变，使得RNA加工过程中，对内含子的识别和剪接出现错误，剪接不完全，导致成熟mRNA比正常mRNA核苷酸多，编码蛋白质时可能对密码子的识别出现错位，也可能编码的蛋白质无法形成正常β-球蛋白的空间构像等，最后使患者缺失β-球蛋白。

5 说明研究两个已知蛋白质间相互作用关系的酵母双杂交技术的分子生物学原理。

很多真核生物的位点特异转录激活因子通常具有两个可分割开的结构域，即DNA特异结

合域（DNA-binding domain，BD）与转录激活域（Transcriptional activation domain ，AD）。这两个结构域各具功能，互不影响。但一个完整的激活特定基因表达的激活因子必须同时含有这两个结构域,否则无法完成激活功能。不同来源激活因子的BD区与AD结合后则特异地激活被BD结合的基因表达。基于这个原理，可将两个待测蛋白分别与这两个结构域建成融合蛋白，并共表达于同一个酵母细胞内。如果两个待测蛋白间能发生相互作用，就会通过待测蛋白的桥梁作用使AD与BD形成一个完整的转录激活因子并激活相应的报告基因表达。通过对报告基因表型的测定可以很容易地知道待测蛋白分子间是否发生了相互作用。 酵母双杂交系统由三个部分组成：(1)与BD融合的蛋白表达载体，被表达的蛋白称诱饵蛋白(bait)。(2)与AD融合的蛋白表达载体，被其表达的蛋白称靶蛋白(prey)。(3)带有一个或多个报告基因的宿主菌株。菌株具有相应的缺陷型。双杂交质粒上分别带有不同的抗性基因和营养标记基因。这些有利于实验后期杂交质粒的鉴定与分离。根据目前通用的系统中BD来源的不同主要分为GAL4系统和LexA系统。后者因其BD来源于原核生物，在真核生物内缺少同源性，因此可以减少假阳性的出现。

6 举三例RNA的研究成就并说明其在推动分子生物学发展中的重要意义。 7.说明constitutive splicing与alternative splicing, cis-splicing与trans-splicing之间在概念及机制上的区别。

组成型剪接：真核细胞在正常生理条件下发生的常规的RNA剪接。

选择型（可变）剪接：mRNA前体的不同剪接方式。其中的某个或某些外显子被代替、添加或删除，结果一个基因可产生多种信使核糖核酸（mRNA），从而翻译得到多种蛋白质。

顺式剪接：将一个信使核糖核酸（mRNA）前体中的各个内含子切除，并将相互邻近的各个外显子加以连接，形成成熟的mRNA的过程。在这个过程中，各个外显子都来自同一个mRNA分子。

反式剪接：由两个分立的RNA分子各失去一部分序列而连接为成熟的剪接产物。两种独立的基因产物，不产生共线性的中间产物，通过一系列的磷酸转酯反应，直接将两个外显子剪接在一起。 顺式剪接与反式剪接的区别见P170

8.简述前体mRNA经过剪接形成mRNA的过程；9.核内mRNA前体是按 GU／AG规则进行剪接的，还有什么机制可以从RNA初级转录物中剪接内含子? 10.哪三个序列对原核生物mRNA的精确转录是必不可少的?

-35(RNA聚合酶结合位点)、-10(RNA聚合酶起始位点)启动子序列和终止子 11.什么是可变剪接？它是怎样造成：

(1)在不同的组织中基因活性不同？(2)单个基因翻译产生两个不同的多肽？

12.什么是增强子? 它们与其他调控序列有何不同? 增强子具有哪些特点?

增强子：可强烈促进一个或几个基因转录的DNA元件，增强子通常位于作用基因的上游，但当它们被反转或移到几百甚至几千碱基对外时，也能发挥作用。 ①可以从非常远的距离使它的靶基因转录活性增加达1000倍；

②作用不依赖方向和位置，可位于基因的上游、下游甚至所调节基因的内部，通过使内部成环突出而实现与基本转录装置相互作用，能同时影响两侧两个基因的表达； ③必须与受调控的基因位于同一DNA分子中，但可位于任一条DNA链上；

④包含有功能的成簇的功能位点群--增强子元。可调节多个启动子，没有基因特异性，可以对其进行克隆、重组和转移；

⑤有组织和细胞的特异性，其表达需要特异蛋白因子的作用； ⑥优先作用于最邻近启动子的转录；

⑦与增强子结合的蛋白包括激素受体蛋白，因而，发育过程中增强子可能在基因活性的调控中起重要作用

13.说明真核生物前体 RNA加工的类别及机理。

14.在DNA分离过程中，酚通常与氯仿联合使用，即使不联合使用也要在苯酚抽提后用氯仿再抽提一次，为什么?

酚可以使蛋白质变性，同时酚会抑制很多酶反应（比如限制性酶切反应），用酚处理匀浆时，蛋白质分子溶于酚相，DNA溶于水相，但水饱和酚的比重略比水重，碰到高浓度的盐溶液，离心后酚相会跑到上层，不利于含质粒的水相的回收。加入氯仿后可以增加其比重，使得酚/氯仿始终在下层，方便水相的回收。另外，酚与水有很大的互溶性，如果单独用酚抽提后会有大量的酚溶解到水相中，因此如果单独用酚抽提后一定要用氯仿抽提一次将水相中的酚去除。而用酚/氯仿混合液进行抽提，跑到水相中的酚则少得多。

15.一个基因如何产生两种不同类型的mRNA分子?

第一种是：一个原初产物含有一个以上的多聚腺苷化位点，能产生具不同3’端的mRNA。第二种是：如果一个原初转录产物含有几个外显子，发生选择性，产生多种mRNA，编码同源异型蛋白质。

16.什么是转录起始前复合体?

参与真核生物转录起始的第一步是TFIID因子对TATA盒的识别，TFIID是一组蛋白质的复合体，它包括了TATA盒结合蛋白(TBP)和至少8个以上的TBP辅助因子（TAF），TBP通过DNA的小沟与TATA盒发生专一性作用，并且使小沟变宽，TFIIA作为一种TAF,与TFIID和其中的TBP结合，能增强并稳定TFIID与TATA盒的结合，形成“前转录起始复合体”（pre-TIC）。

17.为什么把同样的第一外显子(SL外显子)加在所有mRNA上对锥虫是有利的? SL RNA的迷你外显子含有ATG-启动子，它是完整mRNA拥有正确的开放阅读框（open reading frame）的前提。

18.将带有启动子和终止子在内的玉米Adh完整基因导入E. coli细胞内没有得到表达，其主要原因是什么？

玉米基因属于真核基因，含有内含子，而E.coli属于原核细胞，不含有将Adh基因前转录物进行RNA加工（包括5’端加帽，3’端加尾，内含子剪接，RNA编辑和内部腺嘌呤甲基化）所需的酶系，故即使有转录物，也不能翻译出用功能的蛋白，即无法得到表达。

19.有一个被认为是 mRNA的核苷酸序列，长300个碱基，你怎样才能： (1)证明此RNA是mRNA而不是 tRNA或rRNA。 (2)确定它是真核还是原核mRNA。

20.包含?? 的E.coli RNA聚合酶全酶识别的一个的E.coli启动子-10 框的非模板序列为5’-CATAGT-3’，（a）在第一个位置发生的C→T突变是Up-mutation还是Down-mutation？为什么？ （b）在最后位置发生的T→A突变，是Up-mutation还是Down-mutation？为什么？

（a）Up-mutation,C→T使三个氢键连接变为两个氢键连接，双螺旋稳定性减弱，易解链，而-10框正好是原核生物启动子的解链区域，即表现为转录率上升，上调突变。（b）可能Up-mutation也可能Down-mutation也可能不变，T→A突变并没有改变键的个数即双螺旋的稳定性，只能猜测可能的情况。 21.根据提供的（a）mouse total DNA × mouse globin pre-mRNA ，

??

（b）mouse total DNA × mature mouse globin mRNA 杂交的电镜图像，说明你

得到的信息。

第五章 二、问答

1. 什么是摇摆假说?

同义密码子的第1、2位碱基是保守的，同相应的tRNA上的反密码子2、3位形成标准的watson-crick碱基配对，而第3位碱基是可变的，与tRNA反密码子的第1位碱基之间的配对有某种程度的灵活性（由于反密码子位于tRNA的突环上，使反密码子三联体的排列呈弯曲弧线，不能与密码子保持完全平行，加上反密码子的第1个核苷酸位于非双链结构的松弛环内，摇摆的自由度大，形成非标准的碱基配对，称为摇摆位点），摇摆性使同一种tRNA上的反密码子可以与几种或多种密码子配对结合。 如果tRNA的摇摆位点是被修饰的碱基，就可能出现更多地选择配对关系；线粒体tRNA中具有较多的U含量，使tRNA的二级结构较为松弛，对密码子的识读具有更大的摇摆，对密码子家族采用“三中读二”的识读原则（“超摇摆”），第三位碱基没有任何遗传学意义，密码子家族的遗传寓意仅由第1、2位的两个碱基决定。

生物学意义：仅需32种tRNA便可以解读61种氨基酸密码，大大减少了tRNA的基因种数。对于线粒体只需22种就能满足蛋白质翻译的需要。

2.简述真核与原核细胞中翻译起始的主要区别。

Met ①真核生物的翻译起始于甲硫氨酸，翻译起始和多肽延伸中的甲硫氨酸分别由tRNA和itRNAeMet负载，而原核生物翻译起始于N-甲硫氨酸（氨基N端发生甲酰化修饰形成N-甲酰

甲硫氨酸后去甲酰化），翻译起始的甲硫氨酸由tRNAMet负载；②真核生物mRNA中没有fSD序列，而是以真核生物特有的5’端帽子结构作为起始因子的结合位点；③真核生物起始定位比原核生物需要更多的间接过程、更多的辅助因子。

3.如果你发现了一种新蛋白质，你将如何进行下一步研究?请按先后顺序列出基本方

案。

4.起始tRNA具有哪两种与其他 tRNA不同的特性?

原核生物起始tRNA: ①因为起始密码一般是AUG（有时使用GUG或UUG），使得起始tRNA负载的始终是甲硫氨酸（Met），当起始tRNAMet上的甲硫氨酸被负载f后，其氨基N端立即发生甲基化修饰，形成N-甲酰甲硫氨酸，使后续肽键形成反应只能在甲硫氨酸的羧基端（C）端上进行，保证肽链的延伸只能是N→C方向；②tRNAMet反密f码子臂中缺乏丰富的G/C双链结构，保证了fMet?tRNAMet进入核糖体P位点还可阻止在f形成翻译起始复合体时fMet?tRNAMet进入核糖体的A位点，为第二个氨基酰tRNA进入f核糖体留出A位空间。

5.氨基酸分子如何与正确的tRNA分子连接?

负载过程：ATP进入AARS上的ATP结合位点，与随之进入氨基酸结合位点上的氨基酸在羧基和?磷酸之间发生反应，使氨基酸获得AMP，随后AARS将被活化的氨基酸连接到tRNA氨基酸承受臂的3’末端腺苷酸上。

氨基酸被准确负载于tRNA上的两个重要前提：

①氨基酸分子准确进入并稳定结合到对应AARS的氨基酸位点，准确活化。

氨基酸结合位点的“双筛效应”：双筛结构是指AARS的氨基酸位点上的结合位点和水解位点的两个功能域，由此形成两个不同筛孔的筛板结构，行使对具有相似R基团氨基酸被AMP错误活化后的选择性降解，防止因错误活化而导致错误负载的双筛效应；

②AARS对特定tRNA的准确识别与结合。 AARS对副密码子的识别，为一种AARS所识别的一组同工受体具有相同的副密码子。

6.谈谈保证蛋白质翻译准确率的主要机制有哪些？ ①tRNA对氨基酸的准确负载；

②tRNA反密码子对密码子的准确识读；

③核糖体对进入A位的aa-tRNA-EF-Tu-GTP复合体在成肽键前的最后校对。

7.氨酰tRNA合成酶的功能是什么? 氨酰tRNA合成酶：催化特定的氨基酸准确负载于与其对应的tRNA上的专化性酶类。因此AARS具有双重重要的功能，即结合特定的氨基酸与识别对应的tRNA.1种AARS只能识别装载同一种氨基酸的一组同工受体（tRNA分子）。

第六章 二、问答

1.衰减作用如何调控E. coli中色氨酸操纵子的表达?

衰减作用根据trp-tRNAtrp(色氨酰tRNA)的数量去调节Trp操纵子的表达，而trp-tRNAtrp的数量又取决于细胞中Trp的水平.Trp操纵子mRNA前导序列很长，

包括了编码一个长14个氨基酸的多肽所需的全部遗传信息(包括一个AUG起始密码和一个UGA终止密码)。这个多肽含有两个相邻的Trp残基，因此色氨酰-tRNA对前导肽的翻译是必不可少的。

衰减作用发生的必要条件是：1>翻译产生前导多肽；2>转录和翻译的偶联。这样，当RNA聚合酶转录前导序列的同时核糖体就紧接着结合到新生的mRNA上翻译产生前导肽。mRNA的前导序列包括两对相似的反向重复区段。区段2与区段1和3部分互补，这样1+2或2+3或3+4或1+2和3+4都能通过碱基配对形成茎环结构。 由区段3和4配对形成的茎环结构与Trp操纵子的终止子基本相同。和终止子一样，在其茎的3’一侧具有7个连续的U形成的尾巴。当形成这种衰减子结构时，它就能像终止子一样使转录终止。同时，两个Trp密码位于区段1内，而且前导肽的终止密码在区段l和2之间。

这样，如果色氨酸的量是充足的，那么，trp-tRNAtrp的含量也能够使前导肽的翻译进行到终止密码UGA。结合的核糖体覆盖了l和2两个区域，这样1和2、2和3两个区段就不能形成茎环结构，这就使3，4两个区段形成衰减子环并起到终止子的作用，导致RNA聚合酶分子脱离DNA模板。另一方面，如果色氨酸缺乏，那么存在的trp-tRNAtrp也很少，导致核糖体停止在两个Trp密码之前，这样核糖体仅盖住区段l，并在区段4被转录之前，区段2和区段3形成茎环结构。这个结构的形成阻止了区段3与区段4形成终止子结构。于是，出现通读，使操纵子的其他部分被继续转录。事实上，是mRNA上核糖体所在的位置决定mRNA的二级结构和衰减作用是否发生。衰减作用的实质是：通过对存在于引导区内短肽的翻译与否，调控该操纵子的转录延伸。

2.说明原核生物基因表达的正控制诱导型（positive inducible control）和负控制阻遏型（Negative-represible control）调控的遗传机理。 负调控的诱导模型：调控基因的产物是具有与O位点结合活性的阻遏蛋白，效应物（诱导物）能与阻遏蛋白结合，使其构型改变后失去与O位点结合的能力，从而诱导操纵子的开启。

负控制的阻遏模型：调控基因的产物是没有与O 位点结合活性的失活阻遏蛋白，效应物（辅助阻遏物）能与阻遏蛋白结合，使其构型改变后获得与O位点结合的能力，导致操纵子的关闭。 正调控的诱导模型：调控基因的产物是不具有与UCE位点结合，激活转录活性的激活蛋白，效应物（诱导物）能与激活蛋白结合，使其构型改变后获得激活转录活性，从而启动操纵子的转录。 正调控的阻遏模型：调控基因的产物是具有与UCE位点结合，激活转录活性的激活蛋白，效应物（辅助阻遏物）能与阻遏蛋白结合，使其构型改变后失去与UCE位点结合或激活转录的活性，从而导致操纵子的关闭。

3.正调控和负调控的主要不同是什么? 诱导和阻遏的主要不同是什么?

调控基因编码能与操纵基因结合的调控蛋白，根据调控蛋白对基因表达的作用，调控基因所编码的调控蛋白可分为两种：一是与操纵子结合后能减弱或阻止结构基因转录的调控蛋白称为阻遏蛋白，其介导的调控方式称为负调控；二是与

操纵基因或位于启动子上游的控制因子（UCE）结合后能增强或启动结构基因转录的调控蛋白称为激活蛋白，其所介导的调控方式称为正调控。 无论是在正控制系统中，还是在负控制系统中，操纵子的开启与关闭均受到环境因子的诱导，这种因子能与调控蛋白结合，改变调控蛋白的空间构象，从而改变其对基因转录的影响，这种因子称为效应物。一是凡能诱导操纵子开启的效应物称为诱导物，对应于诱导模型；二是凡能导致操纵子关闭，阻遏转录过程发生的效应物称为辅助诱导物，对应于阻遏模型。

4.简述RNAi的机制。

RNA干涉可分为起始和效应两个阶段。①起始阶段：加入的小分子RNA或者内源产生的dsRNA被切割为21～23个核苷酸长度的小分子干扰RNA片段（siRNA）。在这一过程中，内源的依赖RNA的RNase参与反应，这种酶称为Dicer酶（特异识别双链RNA），它能以一种ATP依赖的方式逐步切割由外源导入或者由转座子转录、病毒感染、反向重复序列的转录等各种方式引入的双链RNA，将RNA降解为21～23bp的双链siRNA，并且每一个片段的5’端被磷酸化、3’端都有2个碱基突出，此结构形式是siRNA进入蛋白复合体所必需的。

②效应阶段：siRNA双链首先与一个核酶复合物结合形成RNA诱导的沉默复合物（RISC）。随后，消耗ATP能量将双链siRNA解链为单链的小分子RNA。siRNA的两条链对形成活性RISC复合物是非对称的，其中一条易于进入复合体中，而另一条则较难，而且只有与靶mRNA序列互补的单链siRNA进入RISC才能激活RISC。激活的RISC中存在另一种与Dicer的RNase，并在距离siRNA3’端12个碱基的位置切割mRNA形成25个核苷酸长度的片段。被激活的RISC可以催化多轮剪切反应，使得靶mRNA被完全降解。

另一种模型：随机降解的PCR（线虫和植物），依赖RNA的RNA聚合酶RdRP以配对的siRNA为引物，以靶RNA为模板，类似PCR扩增形成dsRNA，然后由Dicer切割形成新的siRNA,进入下一步反应。

5.简述反义RNA的机制。

存在于细胞质中的反义RNA分子，可与游离的靶mRNA的5’-UTR（原核生物的SD序列）以及编码序列部分结合，形成部分双链引起核糖体结合区域的二级结构发生变化，阻止核糖体的前进，mRNA翻译被迫中断；或者反义RNA与靶序列结合后形成的dsRNA被RNase H降解，抑制了靶基因蛋白质的合成。

存在于细胞核中的反义RNA分子，则可以与前体mRNA结合，如配对区域内有内含子存在，则该内含子受反义RNA分子覆盖，不能被剪切，加工后的mRNA中则包含有内含子的存在，导致前体mRNA的选择性剪接方式的改变；同样的，前体mRNA与反义RNA分子配对形成dsRNA后，被RNase降解。

6.蛋白质前体的加工有哪些形式？ N端甲硫氨酸和信号肽的切除； 新生肽链剪切加工； 多肽的修饰； 二硫键的形成； 亚基的聚合。